免疫組化輔助試劑包（SP法）

使用說明書

僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!

第1版（2016年04月修訂）

[產(chǎn)品信息]

通過生物素標記的二抗（抗抗體）與結合在組織切片上的一抗特異性結合形成免疫復合物，為進一步提高信號的強度，借助生物素和鏈霉親和素信號放大系統(tǒng)，生物素會和辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素結合，形成更為復雜的聚合物。位于聚合物上HRP會催化底物H₂O₂與DAB反應，最終形成棕褐色不溶性色原，特異性的將免疫原在組織和細胞中標定出來，通過顯微鏡觀察確定免疫原的最終位點。

[試劑組分]

[備選指標]

[適用范圍]

本產(chǎn)品僅用于免疫組化實驗，適用于手工和機器大批量操作。本試劑僅對10%中性緩沖福爾馬林固定石蠟包埋的組織進行了驗證，不作其他用途。

[儲存及有效期]

2～8℃避光保存，不得凍存；產(chǎn)品有效期為6個月。

[實驗操作]

1、完成IHC實驗還要的設備和試劑

   a)、移液器、恒溫箱、修復儀、免疫組化筆、計時器、孵育盒、染色架、蓋玻片、光學顯微鏡、洗瓶。

   b)、DAB顯色液：利用顯色劑稀釋DAB顯色液到工作液濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

   c)、pH 6.0，0.01M枸櫞酸鈉抗原修復液：利用雙蒸水稀釋到工作液濃度使用。

1、實驗步驟

（1）烘片：鉛筆標記用于區(qū)分石蠟切片，65℃，1-2h。

（2）脫蠟至水：烘片結束，石蠟切片依次于二甲苯I 30min，二甲苯II 30min，100%、100%、95%、80%、70%的乙醇中各10min，再放入純水里10min。

（3）抗原修復。高溫高壓法和微波法自選。

      高溫高壓法：壓力鍋中加入pH 6.0 ，0.01M枸櫞酸鈉抗原修復液約1000ml，切片插入塑料架上，放入壓力鍋，蓋上鍋蓋（此時不扣上壓力閥）1600W預熱至沸騰，扣上壓力閥1300W，待高壓鍋閥門噴氣開始計時，修復時間為2分鐘。

      微波法：取一定量pH 6.0 ，0.01M枸櫞酸鈉抗原修復液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，微波低火處理3分鐘，放置8分鐘后低火3分鐘，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗3分鐘×3次。

（4）阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。加入適量的內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10分鐘；PBS緩沖液沖洗3分鐘×3次。

（5）非特異性位點的封閉：甩去殘夜，滴加封閉血清工作液覆蓋切片，約200ul/片，室溫孵育20min。

（6）滴加一抗。根據(jù)組織大小，滴加適量的一抗，37℃孵育60分鐘；PBS緩沖液沖洗3分鐘×3次。

（7）根據(jù)實驗物種的差異選擇合適的生物素標記抗IgG聚合物，滴加100μL或適量的生物素標記抗IgG聚合物，37℃孵育30分鐘；PBS緩沖液沖洗3分鐘×3次。

（8）滴加辣根酶標記鏈霉親和素工作液。滴加100uL或適量的辣根酶標記鏈霉親和素工作液，37℃孵育30分鐘；PBS緩沖液沖洗3分鐘×3次。

（9）顯色。加入適量新鮮配制的DAB，室溫孵育5秒-5分鐘，根據(jù)顯微鏡下著色情況終止反應。

（10）復染。自來水沖洗，蘇木素染色液孵育2分鐘；滴加1%鹽酸酒精分色1秒、PBS沖洗返藍。

（11）脫水、透明、封片

（12）顯微鏡觀察，拍照。

[注意事項]

1、在每一次染色過程中，必須有空白對照和陰性對照實驗同時進行。

2、如果陽性組織對照不能顯示適當?shù)年栃匀旧?，應判定該批次樣本的檢測結果無效。

3、若生物素標記IgG聚合物孵育溫度過高或孵育時間過長，可能導致染色過強及背景染色。

4、紅細胞和細胞色素 C可能會造成假陽性結果。

5、脫蠟不徹底，容易影響染色效果，建議免疫組化切片脫蠟與常規(guī)HE脫蠟分開。

6、為防止可能出現(xiàn)的假陽性、假陰性結果，在實驗過程中需設置陽性與陰性對照。

7、實驗中滴加試劑時，過多的PBS緩沖液會導致試劑被稀釋，將引起染色強度變?nèi)?，因此，滴加試劑前應除去多余的緩沖液。

8、在實驗操作過程中，請穿戴好手套、眼鏡和實驗服，以及依照相應的實驗流程，做好防護措施。