自上世紀(jì) 70 年代問(wèn)世以來(lái)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定作為一種簡(jiǎn)便、快速的微量 蛋白的定量測(cè)定方法，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的許多領(lǐng)域。

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）是將 抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記結(jié)合的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù) 。 其可分為以下四大類(lèi)：直接 ELISA、間接 ELISA、夾心 ELISA 和競(jìng)爭(zhēng)抑制 ELISA。 而其中，最廣泛用于目標(biāo)抗原或抗體的定量檢測(cè)方法就是雙夾心 ELISA（Double Sandwich ELISA），其通過(guò)將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，通過(guò)待測(cè) 抗原與包被抗體反應(yīng)，接著加入酶反應(yīng)的底物，將底物催化成有色產(chǎn)物，最后 根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定量分析。

作為一種高靈敏度的定量檢測(cè)手段，雙夾心 ELISA 需要通過(guò)將樣品的吸光 度值代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線后才可確定終濃度。因此，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和擬合對(duì) 于實(shí)驗(yàn)的成功與否至關(guān)重要。而對(duì)于初學(xué)者來(lái)說(shuō)，面對(duì)眾多的 ELISA 數(shù)據(jù)分析 軟件（如 EXCEL、SPSS、CurveExpert、Origin 等等），往往不知如何選擇和使 用。由于 EXCEL 是其中科學(xué)工作者日常最普遍的軟件之一，因此接下來(lái)我們將 以此為例，具體介紹一下典型的雙夾心法標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合步驟。

我們選用了 Cloud. Clone 公司的 SEA079Ra，ELISA Kit for Interleukin 6 (IL6)的一次質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值作為參考，如圖 1 所示，實(shí)驗(yàn)人員從最高 100 pg/mL 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（H1 孔），經(jīng)倍比稀釋至 1.56 pg/mL 濃度（B1 孔），陰性對(duì) 照孔為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（第 A1 孔）。

首先，將各孔的吸光度值減去陰性對(duì)照孔吸光度值（本底），得到校正后的 吸光度值（如圖 2 所示），接著，以校正后的吸光度值為 x 軸（Optical Density）， 相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 y 軸（Concentration (pg/mL)，作 XY 散點(diǎn)圖(如圖 3 所示 的綠色突出顯示部分)，得到一條 7 點(diǎn)曲線。（此類(lèi)曲線一般為直線、近似直線 或 S 型（如圖 3 所示）。

接著，在該曲線中任選一點(diǎn)以右鍵打開(kāi)，選擇”添加趨勢(shì)線(R)”，圖表上 便會(huì)彈出一個(gè)對(duì)話框。當(dāng)目測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線為直線或近似直線時(shí)，則可在“類(lèi)型” 選項(xiàng)中選擇“線性(L)”，而當(dāng)目測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線為 S 型時(shí)，則可在“類(lèi)型”選項(xiàng)中 選擇“多項(xiàng)式(P)”并將“階數(shù)(P)”設(shè)定為 2 階。最后，在“選項(xiàng)”中勾選“顯 示公式(E)”和“顯示 R 平方值(R)”（如圖 4 所示），點(diǎn)確定，便會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲 線的對(duì)應(yīng)公式及 R 2值（如圖 5 所示）。

在了解了標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法之后，我們?nèi)绾闻袛嘁粭l標(biāo)準(zhǔn)曲線是否良好 呢？一般而言，一條好的標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)具備以下三點(diǎn)：

1）陰性對(duì)照孔 OD 值小于 0.25；

2）R²值大于 0.95，越接近 1 越好；

3）最高濃度孔的標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值應(yīng)至少大于 0.8。

最后，我們將繪制和分析標(biāo)準(zhǔn)曲線過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題及相應(yīng)的解決方案總 結(jié)如下：