傳統(tǒng)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過不斷的改進(jìn)優(yōu)化，具有生產(chǎn)周期短、效率高、成本低等一系列的優(yōu)點(diǎn)，但是也存在系統(tǒng)自身的缺陷性，除了無法完成真核蛋白的折疊與修飾外，至今人們利用該系統(tǒng)仍無法解決膜蛋白以及一些毒性蛋白表達(dá)，嚴(yán)重制約著大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。為彌補(bǔ)原核表達(dá)系統(tǒng)的不足，人們常用真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)重組蛋白，但是真核表達(dá)系統(tǒng)步驟繁瑣、周期長(zhǎng)、蛋白產(chǎn)量低、費(fèi)用高等一系列問題，也給真核表達(dá)系統(tǒng)的推廣應(yīng)用設(shè)置了一個(gè)比較高的門檻。目前，隨著人們對(duì)蛋白表達(dá)系統(tǒng)研究的不斷深入，使得蛋白的無細(xì)胞表達(dá)從可能變成了現(xiàn)實(shí)，解決了膜蛋白和毒性蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中無法表達(dá)或僅能以包涵體形式存在的難題。

大腸桿菌無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)目前最為常見的是E. coli S30提取物表達(dá)系統(tǒng)。E. coli S30提取物系統(tǒng) (E. coli S30 Extract Systems) 是利用omp T 胞內(nèi)蛋白酶和lon蛋白酶活性缺失突變體菌株E. coli B制備而來，通過添加氨基酸、T7 RNA聚合酶和能量物質(zhì)等來實(shí)現(xiàn)目的蛋白的表達(dá)。

大腸桿菌無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備目的蛋白基本原理如下：1、質(zhì)粒DNA或是直接的PCR產(chǎn)物，在RNA聚合酶的作用下在體外合成mRNA；2、利用細(xì)胞抽提物中的轉(zhuǎn)錄因子、各類合成蛋白質(zhì)所需的酶和外加補(bǔ)充的氨基酸、能源物質(zhì)、tRNA等將mRNA翻譯成蛋白質(zhì)；3、轉(zhuǎn)譯后釋放的mRNA再循環(huán)利用無細(xì)胞系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)，重復(fù)數(shù)次后mRNA失活。

大腸桿菌無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備目的蛋白的流程大致如下：1、E. coli B 菌液制備，生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期收集菌體；2、大腸桿菌細(xì)胞破碎（超聲波、玻璃珠研磨、低溫高壓等），制備E. coli S30提取物系統(tǒng)；3、加入氨基酸、T7 RNA聚合酶和能量物質(zhì)等構(gòu)成反應(yīng)體系；4、表達(dá)質(zhì)粒的加入，孵育，檢測(cè)；5、目的蛋白純化。

大腸桿菌無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，具有更多的優(yōu)勢(shì)：

1、可以直接利用PCR的基因片段作為模板表達(dá)目的蛋白，省略載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、陽性克隆篩選、表達(dá)等大量的步驟，節(jié)省大量時(shí)間；

2、可以直接實(shí)現(xiàn)多個(gè)蛋白在同一體系中同時(shí)表達(dá)，直接用于蛋白互作驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)；

3、通過96T板等，可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)蛋白的同時(shí)表達(dá)，完成蛋白的快速篩選；

4、實(shí)現(xiàn)標(biāo)記蛋白的制備，以及特殊氨基酸的引入；

5、實(shí)現(xiàn)跨膜蛋白的表達(dá)，解決部分蛋白原核表達(dá)為包涵體的難題；

6、可以直接干預(yù)蛋白的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)蛋白表達(dá)的人為操控。

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