為研究蛋白的性質(zhì)、含量、結(jié)構(gòu)與功能，以及為了方便對抗原抗體特異性結(jié)合的實驗現(xiàn)象進行觀察和檢測，通常會選擇利用一些易測定又具有高度敏感性的物質(zhì)作為標(biāo)記物標(biāo)記抗原，然后通過檢測這些標(biāo)記物的增強放大效應(yīng)而產(chǎn)生的顏色變化、光譜變化等來達到研究目的。即利用抗原中氨基酸殘基的特殊理化性質(zhì)，在特定的條件下使蛋白/抗體與標(biāo)記物結(jié)合，形成蛋白/抗體標(biāo)記物。標(biāo)記抗原原理示意圖如下：

標(biāo)記蛋白一般可采用酶標(biāo)記、生物素標(biāo)記、熒光標(biāo)記以及C13和N15全蛋白標(biāo)記等方式。

標(biāo)記抗體一般可采用酶標(biāo)記、生物素標(biāo)記、熒光標(biāo)記以及膠體金標(biāo)記等方式。

下面針對幾種常見的標(biāo)記方法為大家展開介紹。

1）酶標(biāo)記：酶標(biāo)記物包括酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體和酶標(biāo)記SPA等。酶標(biāo)記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否，因此被稱為關(guān)鍵的試劑。酶標(biāo)記物中最常用的是酶標(biāo)記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而成。酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，常用的高質(zhì)量的酶，如辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，Β-D-半乳糖苷酶等國內(nèi)已有商品供應(yīng)。高質(zhì)量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡便易行的方法。

2）生物素標(biāo)記：生物素廣泛分布于動、植物組織中，從含量較高的卵黃（α型）和肝組織（β型）中提取α、β兩型的生物活性基本相同，現(xiàn)已可人工合成。生物素在機體內(nèi)以輔酶形式參與各種羧化酶反應(yīng)，故又稱為輔酶R或維生素H。分子量為244.31，分子中有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中I環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親合素結(jié)合的主要部位；II環(huán)為噻唑環(huán)，上有一戊酸側(cè)鏈，其末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的唯一結(jié)構(gòu)。

    常用的活化生物素：

    標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素：N-羥基丁二酰亞胺酯（BNHS）；

    標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素：酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）；

    標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素：3-（N-馬來酰亞胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。

    標(biāo)記核酸的活化生物素：常用于標(biāo)記核酸分子的活化生物素有光生物素、生物素脫氧核苷三磷酸、BNHS和BHZ。

3）熒光標(biāo)記：熒光，又作“螢光”，是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的入射光照射，吸收光能后進入激發(fā)態(tài)，然后立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的的波長長的出射光；而且一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。具有這種性質(zhì)的出射光就被稱之為熒光。利用熒光染料與被研究對象的某個基團吸附或共價結(jié)合后其熒光特性發(fā)生改變，從而反映有關(guān)研究對象性能的信息。

    常用的熒光標(biāo)記物有能發(fā)出綠色熒光的異硫氰酸熒光素(FITC)和菁染料琥珀酰亞胺酯(Cy3)，能發(fā)出紅色熒光的四乙基羅丹明(RB200) ，四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)和化青素(Cy5)等。

4）膠體金標(biāo)記：金標(biāo)記免疫分析技術(shù)也稱免疫膠體金技術(shù)，是于1971年建立的一種信號顯示技術(shù)。近10多年來，利用硝酸纖維素膜（NC）等為固相載體，以膠體金標(biāo)記的抗原或抗體與特異配體的反應(yīng)在膜上進行，建立了快速的金標(biāo)記免疫滲濾技術(shù)和金標(biāo)記免疫層析技術(shù)，并在傳染病、心腦血管病、風(fēng)濕病、自身免疫病的免疫學(xué)檢測中廣泛應(yīng)用。

膠體金是指金微小粒子（0-100nm）分散在另一種物質(zhì)中所形成的體系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶膠，用此金溶膠標(biāo)記蛋白質(zhì)（抗原、抗體或SPA、SPG），膠體金顆粒具有高電子密度的特性，故在金標(biāo)蛋白的抗原抗體結(jié)合處，顯微鏡下可見黑褐色顆粒；當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的標(biāo)記處大量聚集時，可在載體膜上呈現(xiàn)紅色或粉紅色斑點，從而用于抗原或抗體物質(zhì)的半定量或定性。它的原理是將氯金酸（HAuCl4）用還原法制成一定直徑的金溶膠顆粒（膠體金），標(biāo)記金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）或抗體，用于免疫印跡、免疫組織化學(xué)定位或快速免疫滲濾、免疫層析實驗。

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