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?自2004年9月，《自然》首次刊登了美國(guó)科學(xué)家Andrew Z. Fire與Craig C. Mello等人撰寫(xiě)的關(guān)于RNA干擾的成果文章，揭示了小RNA在生物生命活動(dòng)中重要的調(diào)控作用開(kāi)始，現(xiàn)在幾乎每天都會(huì)有文章對(duì)各種小RNA與機(jī)體發(fā)育等生命活動(dòng)之間關(guān)系的進(jìn)展進(jìn)行報(bào)道。而精明的生物技術(shù)公司也正在以驚人的速度積極地將RNAi技術(shù)運(yùn)用于藥物篩選研究。云克隆現(xiàn)已針對(duì)慢病毒與腺病毒表達(dá)系統(tǒng)展開(kāi)了一系列服務(wù)項(xiàng)目，其中就有RNAi這一項(xiàng)。

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?RNAi (RNA interference) 即RNA干擾，是由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的、由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象,它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)。RNAi 廣泛存在于生物的各種生命活動(dòng)中。

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?RNA干擾的實(shí)驗(yàn)流程圖如下：

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?以人CDHE基因?yàn)槔?，我們通過(guò)工具網(wǎng)站及查閱文獻(xiàn)選取出三個(gè)RNAi的靶位點(diǎn)，將三個(gè)靶位點(diǎn)的shRNA骨架插入pLKO.1載體，得到重組質(zhì)粒：pLKO.1-shCDHE-1, pLKO.1-shCDHE-2, pLKO.1-shCDHE-3，測(cè)序驗(yàn)證是否正確，得到驗(yàn)證結(jié)果后，選擇正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

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?那么通過(guò)哪些方面可以檢測(cè)RNA的干擾效率呢？

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mRNA水平我們選用RT-PCR（Real-time PCR）進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示：

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?由RT-PCT結(jié)果可見(jiàn)，在兩種細(xì)胞中sh-CDHE-2都能下調(diào)CDHE mRNA的水平，RNAi有效果。

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?蛋白質(zhì)水平我們可以用Western-blot、ELISA、免疫組化的方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示：

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?由WB結(jié)果可見(jiàn)，在293T細(xì)胞中sh-CDHE-1和2均有一定效果，能下調(diào)相關(guān)蛋白的表達(dá)，與RT-PCT結(jié)果一致。

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?由于使用RNAi技術(shù)可以特異性干涉特定基因的表達(dá)(長(zhǎng)度超過(guò)三十的dsRNA會(huì)引起干擾素毒性)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領(lǐng)域。

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?云克隆正在進(jìn)一步挖掘RNAi技術(shù)潛在的強(qiáng)大功能。目前除基因沉默外，云克隆還開(kāi)展了基因過(guò)表達(dá)及基因敲除項(xiàng)目，三個(gè)項(xiàng)目齊頭并進(jìn)，均取得了顯著的成效。

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