從DNA結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)使得人們初步認(rèn)識(shí)基因結(jié)構(gòu)，到PCR技術(shù)的出現(xiàn)實(shí)現(xiàn)基因的體外擴(kuò)增，再到基于PCR技術(shù)的基因測(cè)序技術(shù)使人們第一次看到了人類基因組庫(kù)的信息全貌。但是無論基因操作技術(shù)如何發(fā)展，都改變不了人們對(duì)基因編輯技術(shù)的狂熱追求，因?yàn)樗苯雨P(guān)系到人類疾病的診斷和治療、優(yōu)生優(yōu)育以及人種的進(jìn)化。 基因編輯技術(shù)大致經(jīng)歷了3個(gè)發(fā)展階段，以“鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）”、“類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）”為代表的第一、二代技術(shù)以及以CRISPR/Cas9為代表的源于細(xì)菌一種獲得性免疫系統(tǒng)的三代技術(shù)。CRISPR/Cas9技術(shù)相比前兩代技術(shù)，具有成本低、制作簡(jiǎn)便、快捷高效的優(yōu)點(diǎn)，讓它迅速風(fēng)靡于世界各地的實(shí)驗(yàn)室。近年來應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)表的高水平文章達(dá)到了10000余篇，該技術(shù)也是目前唯一被驗(yàn)證可應(yīng)用于臨床治療的基因編輯技術(shù)，被譽(yù)為“基因超級(jí)剪刀”。

云克隆一直致力于基因編輯技術(shù)的開發(fā)和研究，有CRISPR/Cas9技術(shù)平臺(tái)及與之配套的慢病毒和腺病毒轉(zhuǎn)染平臺(tái)技術(shù)體系。CRISPR/Cas9基因編輯載體包含Cas9表達(dá)元件、sgRNA轉(zhuǎn)錄元件、篩選標(biāo)記元件、原核復(fù)制元件等，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染質(zhì)粒偏大，采用傳統(tǒng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染效率不高，而且效果不穩(wěn)定，難以達(dá)到預(yù)期目的, 但慢病毒和腺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)能很好的解決這個(gè)問題。慢病毒和腺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中的病毒株系均采用可感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒改造而來，從而使他們變成了一個(gè)很好的基因載體，通過篩選重組病毒并進(jìn)行富集，便可直接用于侵染目的細(xì)胞。在重組病毒對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行侵染的過程中，CRISPR/Cas9結(jié)構(gòu)就會(huì)隨著重組病毒基因組一并進(jìn)入到目的細(xì)胞中（如圖1所示）。通過這個(gè)侵染過程，一方面保證了目的片段對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，另一方面借助病毒的表達(dá)原件實(shí)現(xiàn)了Cas9和sgRNA的高效表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，以保證對(duì)目的細(xì)胞基因組特定位點(diǎn)的高效剪切（如圖2所示）。

我們采用慢病毒轉(zhuǎn)染和CRISPR/Cas9技術(shù)相結(jié)合，對(duì)MCF-7細(xì)胞BECN1基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯。首先我們選擇人BECN1基因的兩個(gè)外顯子區(qū)域中三個(gè)23堿基構(gòu)成的CRISPR/Cas9靶序列（N20NGG）（如圖3所示），通過化學(xué)合成方法得到20nt的guide序列及其互補(bǔ)序列，sgRNA及其互補(bǔ)序列退火形成雙鏈，借助BsmBI單酶切和酶連構(gòu)建含有sgRNA序列信息的LentiCRISPRv2重組載體（如圖4所示），LentiCRISPRv2中含有CRISPR/Cas9全部組件以及慢病毒的核心組件；接著LentiCRISPRv2重組載體和慢病毒的包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在已共同轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞內(nèi)慢病毒自我包裝形成具有感染性的病毒顆粒，這些病毒顆?；蚪M中也會(huì)包含CRISPR/Cas9的全部組件。收集病毒顆粒直接侵染MCF-7細(xì)胞株，重組病毒基因組會(huì)插入MCF-7細(xì)胞基因組中，通過嘌呤霉素篩選，最終獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞株。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞株內(nèi)，Cas9和sgRNA能夠被穩(wěn)定表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而結(jié)合成剪切復(fù)合體，復(fù)合體被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，以完成對(duì)sgRNA互補(bǔ)DNA片段的剪切，到達(dá)對(duì)目的片段定向剪切目的（如圖5所示）。

對(duì)于基因敲除效果在蛋白水平的表現(xiàn)，我們通過WB做了進(jìn)一步的驗(yàn)證，直接選取篩選過的細(xì)胞作為驗(yàn)證對(duì)象，通過WB技術(shù)半定量檢測(cè)了BECN1蛋白的含量。檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，選取的三個(gè)sgRNA都對(duì)MCF-7細(xì)胞的BECN1基因產(chǎn)生的重新的編輯，通過人為創(chuàng)造的移碼突變使得BECN1蛋白的含量出現(xiàn)了顯著性的下調(diào)。

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?CRISPR/Cas9技術(shù)目前被廣泛的應(yīng)用于基因敲除或基因敲入細(xì)胞系和動(dòng)物的制備，以研究基因功能、疾病治療、物種改造等多個(gè)領(lǐng)域，具有非常廣泛的實(shí)踐使用價(jià)值。云克隆一直致力于CRISPR/Cas9技術(shù)在細(xì)胞系和動(dòng)物方面的應(yīng)用，并在技術(shù)方面進(jìn)行了改進(jìn)，能夠更高效、快速的獲取基因敲除或基因敲入細(xì)胞系和動(dòng)物模型。

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