細胞增殖/抑制實驗方案

一、實驗目的： 

通過檢測待測蛋白對某種細胞的有促進增殖或抑制增殖的作用來評價該蛋白的生物活性。

二、實驗儀器：

倒置顯微鏡 酶標儀 超凈工作臺 CO₂培養(yǎng)箱

三、相關(guān)試劑、耗材：

96孔細胞培養(yǎng)板  胎牛血清  DMEM/1640培養(yǎng)基  CCK8試劑盒

四、實驗步驟：

1 .將待測細胞消化后，用10% DMEM/1640培養(yǎng)基重懸稀釋，按2000-5000 cells/孔接種到96孔板中，每孔100μl?？筛鶕?jù)細胞自身生長狀態(tài)適當調(diào)整接種濃度，抑制實驗可多接種一些。當細胞貼壁后，換無血清的DMEM/1640饑餓過夜。

2. 將孔內(nèi)無血清培養(yǎng)基吸出棄掉，加入用低濃度血清培養(yǎng)基（含1%-5%胎牛血清） 稀釋的待測蛋白，每孔100μl。待測蛋白一般按照10倍梯度稀釋，對照孔加入不含待測蛋白的培養(yǎng)基。

3. 將加入待測蛋白后的96孔培養(yǎng)板放入CO₂培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)，逐日觀察細胞生長。

五、檢測方法：

CCK8測定，使用酶標儀在450mM波長處測定OD值。

注意事項：

1. 細胞接種密度要適中，在4倍鏡下觀察大概占孔板面積30-40%，不能超過50%，否則細胞增殖過快不易觀察結(jié)果。密度過低細胞增殖慢，用CCK8測定結(jié)果不明顯。不同細胞增殖速度不同，要根據(jù)細胞生長特性適當調(diào)整細胞接種密度。

2. 為了降低血清對細胞增殖的影響，貼壁細胞用無血清饑餓過夜后，應(yīng)該用低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，血清濃度不超過5%。

3. 對于懸浮細胞無法進行無血清饑餓，直接用低濃度血清稀釋到合適的濃度接種到96孔板上。

4. 注意種屬特異性，如有種屬特異性，人源重組蛋白要在相應(yīng)的人源細胞系上開展蛋白活性實驗，鼠源重組蛋白需要在相應(yīng)鼠源細胞系上進行試驗。