1.制膠

1）試劑

濃縮膠緩沖液：1M Tris-HCl, pH 6.8, 0.4% SDS

分離膠緩沖液：1.5M Tris-HCl, pH 8.8, 0.4% SDS

丙烯酰胺儲存液：29%丙烯酰胺+1.0%亞甲雙丙烯酰胺

10%過硫酸銨

TEMED(N，N，N‘，N’-四亞甲基乙二胺)

電泳緩沖液：0.025M Tris Base, 0.192M Glycine, 0.1% SDS

考馬斯亮藍凝膠染色液：0.2%考馬斯亮藍R-250，30%甲醇，10%乙酸

考馬斯亮藍凝膠脫色液：30%甲醇，10%乙酸

2）設(shè)備

微型凝膠裝置：Bio-Rad Mini-Protean 3 Dodeca Cell

電源：Bio-Rad PowerPac HC

梯度凝膠儀：Bio-Rad Model 485 Gradient Former

3）實驗操作

在燒杯中按如下成分配制凝膠液，灌注凝膠前應(yīng)加入過硫酸銨和TEMED。

2. 灌注分離膠

加入過硫酸銨和TEMED后，立即輕輕混合，將溶液小心倒入膠槽。當(dāng)分離膠溶液高度達到約150px時停止灌注，在分離膠溶液上倒入約0.5ml異丙醇，以保持凝膠表面平整，靜止放置10-30min使凝膠凝固。

3. 灌注濃縮膠

當(dāng)分離膠凝固后，分離膠和異丙醇之間會出現(xiàn)一個分離界面。去除異丙醇，用蒸餾水沖洗表面。加入過硫酸銨和TEMED后，立即輕輕混合濃縮膠，將溶液倒入膠槽，直到溶液到達前板頂部。小心地將梳子插入凝膠中，直到梳子的底部到達前板的頂端，靜止放置10-30min使凝膠凝固。

4. 加樣

濃縮凝膠凝固后，拆卸梳子，將凝膠放入電泳室，在內(nèi)外儲層加電泳緩沖液。將樣本和適量蛋白質(zhì)標(biāo)記裝入孔中（每個樣本20-25ug總蛋白）

5. 凝膠電泳

蓋上蓋子，并將電極插頭連接到合適的電極上。打開電源調(diào)整電壓至80V，電泳約30分鐘。當(dāng)樣品形成單條窄線并進入分離膠時，將電壓轉(zhuǎn)換為150V，當(dāng)移至凝膠底部時，停止電泳。大約需要40-60min。

6. 凝膠轉(zhuǎn)移

1）試劑

10X轉(zhuǎn)膜液：0.25M Tris, 1.92M甘氨酸，稀釋至1X緩沖液后加入甲醇使其濃度為10%，需現(xiàn)配現(xiàn)用。

封閉液：1 X PBS, pH=7.4加入5.0%脫脂奶粉

PVDF膜

2）設(shè)備

轉(zhuǎn)膜儀：Bio-Rad Trans-Blot Cell

電源：Bio-Rad PowerPac H

7. 電轉(zhuǎn)

依次將PVDF膜置于100%甲醇中30秒，轉(zhuǎn)膜液中至少1min。按照說明書裝好電轉(zhuǎn)儀，在電轉(zhuǎn)儀上一次鋪好海綿、濾紙、膜、膠、濾紙、海綿，填充預(yù)冷轉(zhuǎn)膜緩沖液，并將電極連接起來。將電流設(shè)置為50 mA，轉(zhuǎn)膜過夜。

8. 封閉

將PVDF膜轉(zhuǎn)移至封閉液中。在搖床上室溫搖動1小時，或4℃過夜。

蛋白質(zhì)印跡

1）試劑

20×TBS (pH7.4)：0.1M Tris, 1M NaCl。
TBST溶液：1×TBS, 0.05% Tween-20。

抗體稀釋液：將5%脫脂奶粉加入到TBST溶液中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

顯影液/定影液

洗膜緩沖液: TBST

一抗

二抗：如山羊抗兔IgG（SAA544Rb19）

辣根過氧化物酶底物

X線

2）設(shè)備

搖床

9. 孵育一抗

1) 用抗體稀釋液稀釋一抗至合適的濃度，在室溫下用振動孵育1小時或4℃振動孵育過夜。

2) 洗膜：倒出一抗溶液，用洗膜緩沖液洗膜3次，每次5min。

10. 孵育二抗

1) 用抗體稀釋液稀釋二抗（1:5000，山羊抗兔IgG），室溫下用振動孵育1小時。

2) 洗膜：倒出二抗溶液，用洗膜緩沖液洗膜3次，每次5min。

11. 暗室曝光

在暗室里，將PVDF膜浸潤在ECL底物溶液1min左右，然后用保鮮膜將PVDF膜包好，放入暗盒，進行顯影曝光。