蛋白活性實(shí)驗(yàn)-CD14活性蛋白
蛋白活性實(shí)驗(yàn)-CD14活性蛋白
CD14作為一種共受體(連同toll樣受體TLR 4和MD-2)用于檢測(cè)細(xì)菌脂多糖(LPS)。CD14只能在脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)存在的情況下結(jié)合LPS。雖然LPS被認(rèn)為是其主要的配體，但CD14也能識(shí)別其他的與病原體相關(guān)的分子模式，如lipoteichoic acid。此外，脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)已被鑒定為CD14的中間體，因此進(jìn)行了ELISA結(jié)合檢測(cè)，以檢測(cè)重組人CD14和重組人LBP的相互作用。
活性實(shí)驗(yàn)：用含0.01%的BSA 的PBS (PH7.4)稀釋CD14。將100μl樣本轉(zhuǎn)移到LBP預(yù)包被板中37℃孵育2 h。用抗CD14多抗孵育1小時(shí)后用PBST沖洗，，然后吹吸，沖洗3次。經(jīng)HRP標(biāo)記的二次抗體孵育后，吹吸洗滌3次。加入底物溶液,在37℃孵育15 - 25分鐘。最后，在孔中加入50ul終止液，并立即在450nm處讀取。
CD14還可以通過(guò)THP-1人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞增強(qiáng)LPS刺激的IL-8分泌。因此,THP1細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板106細(xì)胞/毫升的濃度和刺激(1μg /毫升),然后添加不同濃度的重組體人CD14(1μg /毫升,5μg /毫升)。24h后，通過(guò)細(xì)胞因子特異性ELISA測(cè)定了在上清液中IL8的含量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：CD14和LBP的結(jié)合活性如圖1所示，其作用是劑量依賴(lài)性的。CD14的濃度5μg /毫升時(shí),分泌LPS-stimulated引發(fā)可以顯著增加。結(jié)果如表1和圖2所示。
Figure 1. The binding activity of CD14 with LBP
O.D. value | Corrected | Concentration of IL8(ng/mL) | |
stimulated with LPS (1μg/ml) and rh CD14（5μg/ml） | 1.227 | 1.198 | 0.805 |
stimulatedwith LPS (1μg/ml) and rh CD14（1μg/ml） | 0.915 | 0.886 | 0.594 |
stimulatedwith LPS (1μg/ml) | 0.89 | 0.861 | 0.578 |
Table 1. Effects of CD14 on IL8 production by THP1 cells
The standard curve was demonstrated as follows：
STD (ng/mL) | O.D. value | Corrected |
2.5 | 3.556 | 3.526 |
1.25 | 2.245 | 2.215 |
0.625 | 1.097 | 1.067 |
0.3125 | 0.329 | 0.299 |
0.15625 | 0.188 | 0.158 |
0.078125 | 0.117 | 0.087 |
0.0390625 | 0.065 | 0.035 |
Figure 2. Effects of CD14 on IL8 production by THP1 cells