1、酶標(biāo)板包被抗體流程：

1.1 按說明書推薦的比例稀釋包被抗體，或者設(shè)計預(yù)實(shí)驗(yàn)用倍比稀釋的方式稀釋包被抗體，酶標(biāo)孔中加100ul包被抗體包被。酶標(biāo)板加上覆膜，4℃溫育過夜或37℃溫育2小時。

1.2 棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘。在吸水紙上輕拍酶標(biāo)板來移除孔內(nèi)所有液體。此過程也可采用噴射瓶，多道移液器 或自動洗板機(jī)來完成。

1.3 每孔加入200ul封閉液封閉，37℃溫育1.5小時。

1.4 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板1次，方法同步驟1.2。酶標(biāo)板包被抗體完成。

2、實(shí)驗(yàn)流程

2.1 按說明書推薦的方法稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，或設(shè)計預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定倍比稀釋的多個標(biāo)準(zhǔn)品工作液。酶標(biāo)板中依次加入50μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔加50μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，余孔加待測樣品50μL，然后立即每孔加生物素標(biāo)記競爭物工作液 50μL，輕輕振動，混勻，注意不要有氣泡，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育1小時。

2.2 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，方法同步驟1.2。

2.3 每孔加酶標(biāo)親和素工作液（臨用前配制）100μL，酶標(biāo)板覆膜，37℃溫育30分鐘。

2.4 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟1.2。

2.5 每孔加TMB底物溶液90μL，酶標(biāo)板覆膜，37oC避光顯色（反應(yīng)時間控制在10-20分鐘，不要超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）。

2.6 每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請輕輕晃動酶標(biāo)板以使溶液混合均勻。

2.7 在確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長或450/630nm雙波長測量各孔的光密度值（O.D.值）。