隨著大氣污染、吸煙、工業(yè)經(jīng)濟發(fā)展導(dǎo)致的理化因子增多以及人口年齡老化等因素，呼吸系統(tǒng)疾病近年來有明顯增長的趨勢。

由于呼吸疾病涉及的器官較多，包括氣管、支氣管及肺部等，單以肺部為例，所涉疾病就包括肺阻塞、肺纖維化、肺氣腫、哮喘等，下面，武漢云克隆將以大鼠/小鼠為模式動物，介紹幾種常見的肺部疾病動物模型。

 4.特發(fā)性肺纖維化

特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）為不明原因引起的成人慢性、進展性、纖維化性間質(zhì)性肺炎。

    4.1 建模方法:

SPF級C57/BL6雌性小鼠，體重約18~20g。使用氣管滴注博來霉素法建模。

麻醉小鼠，仰臥固定于實驗臺上，頸部去毛后酒精消毒，切開皮膚，逐層暴露氣管，將1mL注射器經(jīng)兩氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入氣管，回抽無阻力，則注入博萊霉素 5mg/kg/L（對照組注入等量的生理鹽水）。手術(shù)完畢后迅速將動物直立、旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)分布均勻，動物清醒后常規(guī)飼養(yǎng)。 

    4.2 模型鑒定及后續(xù)檢測：

肺纖維化模型發(fā)展時間：給藥后第 7 天肺組織大多呈重度肺泡炎改變，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)有大量中性粒細胞浸潤，部分肺泡腔破壞或消失，肺間隔內(nèi)成纖維細胞和毛細血管增生，與正常肺組織對比差別明顯；給藥后第14天，肺纖維化開始形成。巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞明顯減少，成纖維細胞增多，肺泡間隔明顯增厚，有膠原沉積。給藥后第28天，多數(shù)小鼠發(fā)生彌漫性肺間質(zhì)纖維化，肺間質(zhì)被膠原纖維和成纖維細胞替代，肺泡壁破壞，肺大泡形成，但仍可見炎性細胞浸潤。

圖5. 特發(fā)性肺纖維化模型小鼠(右)相對于對照組小鼠肺部組織MASSON染色對比（4周）

5.急性肺損傷模型

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是各種直接和間接致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全。以肺容積減少、肺順應(yīng)性降低、通氣/血流比例失調(diào)為病理生理特征，臨床上表現(xiàn)為進行性低氧血癥和呼吸窘迫，肺部影像學(xué)上表現(xiàn)為非均一性的滲出性病變，其發(fā)展至嚴重階段（氧合指數(shù)<200）被稱為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。

    5.1 急性肺損傷大鼠模型建立

SPF級SD雄性大鼠，體重約200～220g。使用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)建立急性肺損傷模型。

將大鼠放入固定盒中，用酒精檫拭大鼠尾靜脈后，按壓住尾靜脈1/3處，注射器進針后回抽有血后注入LPS溶液（溶于生理鹽水，給藥劑量10mg/kg），從而建立內(nèi)毒素性急性肺損傷大鼠模型。對照組的大鼠尾靜脈注射等體積的生理鹽水。

    5.2 模型鑒定及后續(xù)檢測：

    5.2.1 肺損傷后的目視觀察：

如下圖所示，在急性肺損傷模型小鼠中，肺部有多處明顯滲血，后有肉眼可見肺部大面積出血滲出，可以直觀的反映肺損傷程度。

圖6. 急性肺損傷模型大鼠(右)與對照組大鼠肺部照片對比

    5.2.2 肺的濕/干重比檢測：

肺的濕/干重比是反應(yīng)肺水腫的直接指標，也是反應(yīng)肺損傷嚴重程度的敏感指標。在急性肺損傷發(fā)生后，大量液體滲出至肺泡和肺間質(zhì)，導(dǎo)致肺的重量增大，而肺的干重則不受影響。處死大鼠、剪斷氣管后取全肺，稱濕重，然后將肺置于65℃恒溫箱中干燥，24h 后取出稱干重，計算肺濕/干重比值。

圖7. 急性肺損傷模型大鼠(ALI)與對照組大鼠肺干濕重比隨不同時間點的變化。 

    5.2.3 肺泡盥洗液（BALF）中細胞計數(shù)：

小鼠取血后，開胸，分離縱膈，注射器抽取3ml生理鹽水從氣管插管推入肺中，每次反復(fù)灌洗3次后抽出灌洗液，肺泡灌洗液以4℃ 3000r/min離心15min，取上清，保存于-80度用于后續(xù)檢測。用 PBS沖洗沉淀物，然后用Diff-Quik染色液染色，在光學(xué)顯微鏡下進行細胞分類，觀察計數(shù)計數(shù)中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞。

    5.2.4 肺損傷后的組織病理觀察 ：

取左肺4%多聚甲醛固定，然后將肺組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片（厚度為5μm），HE染色。HE染色肺組織學(xué)評價可以直觀的反應(yīng)肺損傷的程度，ALI組織病理學(xué)主要表現(xiàn)為肺泡中性粒細胞及紅細胞的滲出，肺泡壁透明膜的形成。HE染色后可在低倍鏡下觀察到整個左肺組織的炎癥細胞浸潤、水腫以及損傷，評估肺部損傷分布情況；而高倍鏡下則可以對肺泡結(jié)構(gòu)進行辨認，對肺損傷程度進行評估和評分。

    評分方法：取6個視野進行出血及水腫評分。

0分：沒有損傷

1分：<25%的損傷面積

2分：25%~50%的損傷面積

3分：50%~75%的損傷面積

4分：>75%的損傷面積

圖8. 急性肺損傷模型大鼠(右圖)與對照組大鼠（左圖）肺組織HE染色

 6.哮喘模型

哮喘又名支氣管哮喘。支氣管哮喘是由多種細胞及細胞組分參與的慢性氣道炎癥，此種炎癥常伴隨引起氣道反應(yīng)性增高，導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促、胸悶和/或咳嗽等癥狀，多在夜間和/或凌晨發(fā)生，此類癥狀常伴有廣泛而多變的氣流阻塞，可以自行或通過治療而逆轉(zhuǎn)。

    6.1 哮喘小鼠模型建立

SPF級Balb/c雌性小鼠，體重約20g。采用OVA致敏誘導(dǎo)建立哮喘模型。

OVA致敏誘導(dǎo)的哮喘模型：分別于第1、8、15 天腹腔注射OVA 混懸液（含OVA 1 g /L，氫氧化鋁5 g /L） 0.2 ml，實驗第21 天起將小鼠置于霧化激發(fā)器內(nèi)，給予2% OVA 生理鹽水霧化激發(fā)，1次/d，每次30 min，連續(xù)7 天，將小鼠呼吸急促，搔鼻抓癢、嗆咳煩躁、點頭運動等作為哮喘小鼠模型成功的標準。正常對照組以生理鹽水代替OVA腹腔注射和霧化激發(fā)，操作同上所述。

    6.2 模型鑒定及后續(xù)檢測：

    6.2.1 小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF) TH2型細胞因子蛋白水平檢測

待造模完成后，抽取BALF后用ELISA方法檢測其中TSLP、IL-33和MUC5AC的表達情況。

附支氣管肺泡灌洗液抽取方法：小鼠取血后，開胸，分離縱膈，注射器抽取3ml生理鹽水從氣管插管推入肺中，每次反復(fù)灌洗3次后抽出灌洗液，肺泡灌洗液以4℃ 3000r/min離心15min，取上清。

結(jié)果顯示：哮喘模型小鼠與對照組小鼠相比，炎性因子及趨化因子水平均有顯著性升高。

圖9. 哮喘模型小鼠與對照小鼠BALF中各類細胞因子的表達水平對比

    6.2.2 肺組織病理學(xué)檢測

HE染色檢測：待造模完成后，腹腔麻醉小鼠后，開胸暴露胸腔：取左側(cè)肺葉固定于 10%甲醛溶液 24h，常規(guī)脫水石蠟包埋，切片行 HE 染色，光鏡下觀察。

結(jié)果顯示：空白對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡大小均勻，氣道黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，纖毛排列整齊；模型對照組小鼠肺組織肺間隔增厚，支氣管部分上皮細胞脫落，有淋巴細胞浸潤。

圖10. 哮喘模型小鼠(右)相對于對照組小鼠肺部組織HE染色對比

阿爾辛藍—過碘酸雪夫氏染色（AB-PAS染色）檢測：待造模完成后，腹腔麻醉小鼠后，開胸暴露胸腔：取左側(cè)肺葉固定于 10%甲醛溶液 24h，常規(guī)脫水石蠟包埋脫蠟至水，切片行 AB-PAS染色，光鏡下觀察。

結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組小鼠的肺組織支氣管上皮杯狀細胞增多。

圖11. 哮喘模型小鼠(右圖)相對于對照組小鼠（左圖）肺部組織PAS染色對比