樣本裂解液的制備

1. 細(xì)胞裂解液的制備

1）收集細(xì)胞：將細(xì)胞懸液（懸浮細(xì)胞直接收集，貼壁細(xì)胞可以用細(xì)胞刮或者胰酶消化后收集）收集于離心管中，4℃ 1500rpm離心5min后收集細(xì)胞沉淀；用預(yù)冷的1×PBS洗滌細(xì)胞2次，收集細(xì)胞沉淀。

2）裂解細(xì)胞：向細(xì)胞沉淀中加入提前預(yù)冷的裂解液（裂解液在臨用前加入蛋白酶抑制劑），用槍頭將細(xì)胞團(tuán)塊吹散，放要床上冰上裂解30min（如果細(xì)胞溶解不完全，冰上短時(shí)超聲裂解1-2min）。

3）4℃ 10000rpm離心10min，取適量上清測(cè)蛋白濃度，剩余上清根據(jù)需求分裝與1.5ml EP管中，置于-80℃冰箱保存。 

2. 組織樣本裂解液的制備

1）解剖實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取組織；在冰盒上用剪刀將組織剪碎，每20~50mg對(duì)應(yīng)加入1mL新鮮配置的預(yù)冷裂解液。冰浴條件下玻璃勻漿器研磨樣品或者液氮研磨法（如果未完全溶解，可以短時(shí)超聲裂解1-2min）。

2）4℃ 10000rpm離心10min，取適量上清測(cè)蛋白濃度，剩余上清根據(jù)需求分裝與1.5ml EP管中，置于-80℃冰箱保存。

抗原抗體免疫沉淀步驟

1. 根據(jù)需求取適量的已準(zhǔn)備好的樣本裂解液300-400ul到1.5mL EP管中，加入約等體積的含蛋白酶抑制劑的1×PBS，混勻，冰上操作。

2. 加入1-5ug抗體到樣本裂解液中（陰性對(duì)照用和一抗同種屬來源的IgG），4℃旋轉(zhuǎn)過夜。

3. 取一定量的洗滌好的protein A/G-beads（根據(jù)抗體的亞型選擇Protein A或G，一般50ul左右），分別加入到不同的抗原-抗體混合物的EP管中，4℃旋轉(zhuǎn)4h。

4. 免疫沉淀反應(yīng)后，4℃ 以1000rpm速度離心3 min，棄去上清；然后用洗液洗滌沉淀3次，每次5min；最后一次洗滌留30μl洗液。

5. 向每個(gè)EP管中加入30μl的2×加樣緩沖液，沸水煮5min。

6. 4℃ 10000rpm離心5min，將離心后的上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中并做好編號(hào)，直接上樣進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)。

SDS-PAGE電泳和Western Blot檢測(cè)分析

SDS-PAGE電泳和WB檢測(cè)步驟，請(qǐng)參考：http://02e5ac.cn/topic/201804280916369609.html。