肽酰甘氨酸α-酰胺化單加氧酶（Peptidyl-glycine alpha-amidating monooxygenase, PAM）是多種多肽產(chǎn)生生物活性所必需的酶。它含有兩個(gè)具有催化活性的酶活性域：肽基甘氨酸α-羥基化單加氧酶（PHM）和肽基-α-羥基甘氨酸α-酰胺化裂解酶（PAL）。這些催化結(jié)構(gòu)域依次作用于將神經(jīng)內(nèi)分泌肽催化為活性的α-酰胺化產(chǎn)物。通常，將Dns-Tyr-Val-Gly底物水解為Dns-Tyr-Val-NH2作為PAM的典型活性測(cè)定法。

實(shí)驗(yàn)方法：

1. 在1mL含100mM MES / KOH（pH 6.0）、30mM KI，30mM KCl，1μmol/ L硫酸銅，100ug / mL過(guò)氧化氫酶，1％（v / v）乙醇，0.001％（v / v）Triton X-100、10mM抗壞血酸鹽，0.35mM/L Dns-Tyr-Val-Gly（0.2mg / mL）的溶液中添加各種濃度的PAM（0.1ug / mL，1ug / mL，5ug /毫升）。

2. 在37℃溫育30分鐘。

3. 向反應(yīng)體系中添加6％（v / v）TFA終止反應(yīng)。

4. 通過(guò)RP-HPLC在280nm處進(jìn)行UV檢測(cè)，在25℃下使用Agilent ZORBAX Poroshell SB C18色譜柱（9.4×250mm，5μm）進(jìn)行分析，流速為1ml / min。流動(dòng)相由100 mM乙酸鈉（pH 6.5）和35分鐘的10-90％乙腈線性梯度組成。結(jié)果如圖1所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

圖1.HPLC測(cè)定PAM的活性實(shí)驗(yàn).

圖2.反應(yīng)產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)Dns-Tyr-Val-Gly 和Dns-Tyr-Val-NH2的比較.

 圖3.Dns-Tyr-Val-NH2的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

Cloud-Clone提供的重組PAM（APC744Ra61）的活性為：2.4x10⁶U（一個(gè)活力單位（U）定義為：37℃1分鐘將1umol底物轉(zhuǎn)化為酰胺產(chǎn)物）。