2020年7月15日，來自密歇根大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系的Deepak Nagrath 教授和德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心的Samuel C. Mok 教授在《Nature communications》聯(lián)合發(fā)表了題為“ITLN1 modulates invasive potential and metabolic reprogramming of ovarian cancer cells in omental microenvironment”的文章。研究探討了調(diào)節(jié)卵巢癌擴(kuò)散到大網(wǎng)膜組織的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)ITLN1通過降低MMP1的表達(dá)和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞的代謝轉(zhuǎn)移，抑制了乳轉(zhuǎn)鐵蛋白對卵巢癌細(xì)胞侵襲潛能和增殖的影響。此外，接受ITLN1治療的卵巢癌小鼠腫瘤生長速度明顯下降。這些數(shù)據(jù)表明，在大網(wǎng)膜腫瘤微環(huán)境中，來自間皮細(xì)胞的ITLN1的下調(diào)促進(jìn)了卵巢癌的發(fā)展。

                                                                                       產(chǎn)品：內(nèi)凝集蛋白1 ELISA Kit                        

                                                                                         貨號：SEA933Mu                                     

                                                                                         實(shí)驗(yàn)方法：雙抗夾心                                      

                                                                                         檢測范圍：2.5-160pg/mL

研究簡介：

        上皮性卵巢癌(Ovarian cancer, OC)是美國死亡人數(shù)最多的婦科惡性腫瘤。它最常見于絕經(jīng)后婦女，并優(yōu)先轉(zhuǎn)移到大網(wǎng)膜。大網(wǎng)膜是一種血管化良好的腹膜組織皺褶，是腹腔內(nèi)脂肪聚集的主要部位。這些觀察結(jié)果表明，內(nèi)臟脂肪作為轉(zhuǎn)移微環(huán)境的組成部分，可能對OC的發(fā)展產(chǎn)生負(fù)面影響。然而，大網(wǎng)膜內(nèi)臟組織促進(jìn)腫瘤生長和疾病進(jìn)展的機(jī)制尚不完全清楚。以往的研究表明，脂肪組織可能對腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和化療敏感性有直接的、局部的影響。

        許多研究表明，腫瘤細(xì)胞與間皮細(xì)胞的透明質(zhì)酸膜結(jié)合，以及炎癥介質(zhì)和潛在的細(xì)胞外基質(zhì)暴露引起癌細(xì)胞粘附分子的上調(diào)，可能促進(jìn)癌細(xì)胞的附著和侵襲。然而，OC的間皮細(xì)胞的在細(xì)胞粘附和增長的確切作用尚不清楚。并且，OC細(xì)胞在網(wǎng)膜脂肪組織中調(diào)控間皮細(xì)胞以及其他類型的細(xì)胞以創(chuàng)建一個環(huán)境支持他們的成長和發(fā)展的分子機(jī)制也沒有進(jìn)行過徹底的探索。

        首先，作者對良性婦科疾病患者顯微解剖的大網(wǎng)膜脂肪組織和高度嚴(yán)重卵巢癌(High-grade serous ovarian cancer，HGSC)患者的癌相關(guān)大網(wǎng)膜組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)HGSC患者的大網(wǎng)膜脂肪組織中ITLN1下調(diào)最多，說明OC細(xì)胞下調(diào)了大網(wǎng)膜脂肪組織中ITLN1的表達(dá)。同時，對健康女性的大網(wǎng)膜脂肪組織和HGSC患者的腹水衍生的間皮細(xì)胞進(jìn)行RNA-Seq，發(fā)現(xiàn)ITLN1是癌癥相關(guān)間皮細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)最多的基因。

        基于間皮細(xì)胞是大網(wǎng)膜組織的主要成分之一，作者推測大網(wǎng)膜脂肪組織中的ITLN1主要是由間皮細(xì)胞產(chǎn)生的。通過比較健康女性和HGSC患者原代間皮細(xì)胞中ITLN1的mRNA和蛋白水平并對ITLN1進(jìn)行免疫定位，發(fā)現(xiàn)在大網(wǎng)膜的各種細(xì)胞中，內(nèi)源性ITLN1只有間皮細(xì)胞高表達(dá)，而間皮細(xì)胞中ITLN1的下調(diào)與大網(wǎng)膜微環(huán)境中OC細(xì)胞或細(xì)胞分泌的介質(zhì)的存在有關(guān)。

        因?yàn)镮TLN1是一種分泌蛋白，因此作者檢測了測定了健康女性血清樣本中的循環(huán)ITLN1水平，以及術(shù)前HGSC患者和良性婦科疾病患者的血清樣本。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康女性或良性婦科疾病患者相比，HGSC患者循環(huán)中的ITLN1水平顯著降低。由于OC患者血清中CA125蛋白水平升高，作者對患者血清中CA125和ITLN1蛋白水平之間是否存在相關(guān)性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)HGSC患者的CA125水平明顯高于正常女性或良性婦科疾病患者，并且CA125和ITLN1水平之間存在顯著的負(fù)相關(guān)。之后使用logistic回歸法構(gòu)建了ITLN1、CA125或兩者的受試者工作特征曲線以檢驗(yàn)健康女性和OC女性之間的區(qū)分能力。數(shù)據(jù)表明，ITLN1補(bǔ)充了CA125在OC患者識別中的作用。

        為了評估ITLN1在OC進(jìn)展中的作用，作者進(jìn)行了細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)與磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)處理的SKOV3和A224相比，ITLN1處理的細(xì)胞的行走距離明顯縮短，侵襲程度明顯降低。說明外源性ITLN1可以抑制OC的轉(zhuǎn)移。為了確定ITLN1抑制OC細(xì)胞運(yùn)動和侵襲電位的分子機(jī)制，作者對外源性ITLN1處理的A224進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。從轉(zhuǎn)錄組中，作者選擇了與侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因MMP1進(jìn)行研究。因?yàn)閙RNA 和蛋白在ITLN1處理的SKOV3和A224細(xì)胞中均下調(diào)，表明MMP1介導(dǎo)了ITLN1對OC細(xì)胞運(yùn)動和侵襲電位的影響。

        為了確定ITLN1下調(diào)MMP1的信號網(wǎng)絡(luò)，作者首先將目標(biāo)放在LTF（Lactotransferrin）上。前人研究發(fā)現(xiàn)LTF能與膜結(jié)合形式的ITLN1互作，并且LTF與LRP1（Low-intensity lipoprotein-receptor-related protein 1）結(jié)合轉(zhuǎn)錄上調(diào)MMP1。因此推測ITLN1與LTF結(jié)合，阻止LTF與OC細(xì)胞上的受體LRP1結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致MMP1下調(diào)。首先，作者進(jìn)行了體外pull-down實(shí)驗(yàn)表明ITLN1和LTF結(jié)合。通過Duolink PLA技術(shù)進(jìn)一步證明ITLN1干擾了OC細(xì)胞上LTF與LRP1的結(jié)合。作者發(fā)現(xiàn)大部分LTF信號在大網(wǎng)膜組織中共定位，提示中性粒細(xì)胞是大網(wǎng)膜腫瘤微環(huán)境中LTF的主要來源。并且通過免疫組化分析，HGSC患者的癌相關(guān)脂肪組織中LTF表達(dá)顯著上調(diào)。HGSC患者腹水中富含中性粒細(xì)胞的LTF水平明顯高于任何一組患者的血清。Logistic回歸法構(gòu)建工作特征曲線，發(fā)現(xiàn)LTF聯(lián)合ITLN1和CA125時的曲線下面積明顯大于單獨(dú)聯(lián)合CA125時的曲線下面積，說明LTF聯(lián)合ITLN1在OC患者識別中可補(bǔ)充CA125。

        作者將ITLN1在含有10%胎牛血清(FBS)的抗LTF抗體或IgG的培養(yǎng)液中處理OC細(xì)胞，與SFM種相比，細(xì)胞運(yùn)動和侵襲電位明顯提高；當(dāng)ITLN1加入后，運(yùn)動和侵襲明顯下降。這表明ITLN1抑制了LTF對OC細(xì)胞運(yùn)動和侵襲的影響。當(dāng)SKOV3和A224轉(zhuǎn)染MMP1-specific siRNAs然后用LTF處理后，發(fā)現(xiàn)LTF對OC細(xì)胞的運(yùn)動和侵襲影響消失，這表明LTF對OC細(xì)胞的影響可能通過MMP1介導(dǎo)。

在檢測了LTF/LRP1/MMP1通路中關(guān)鍵中間信號分子在SKOV3和A224中的表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，ITLN1可以消除LTF對這些信號分子的激活作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)LTF處理的SKOV3和A224的應(yīng)力纖維形成和細(xì)胞內(nèi)鈣顯著增加。然而，ITLN1的加入?yún)s減弱了LTF的作用，這表明ITLN1通過調(diào)節(jié)OC細(xì)胞中鈣和應(yīng)力纖維的形成，減弱了LTF的促進(jìn)基序的作用。

        之后，作者發(fā)現(xiàn)ITLN1對OC細(xì)胞的生長沒有直接影響，但是OC細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞和ITLN1共培養(yǎng)的細(xì)胞生長速率顯著下降，將成熟脂肪細(xì)胞替換為前脂肪細(xì)胞和間皮細(xì)胞未觀察到生長抑制作用，這說明只有成熟脂肪細(xì)胞介導(dǎo)了ITLN1對OC細(xì)胞的生長抑制作用。

        然后，作者證實(shí)ITLN1僅在成熟的脂肪細(xì)胞中增加了胰島素依賴性的葡萄糖攝取，而葡萄糖能介導(dǎo)OC細(xì)胞的生長。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在胰島素存在的情況下，ITLN1上調(diào)了脂肪細(xì)胞中GLUT4的表達(dá)，導(dǎo)致葡萄糖攝取增加。然而，在ITLN1處理的成熟脂肪細(xì)胞中，與對照組相比，在沒有胰島素的情況下，GLUT4 mRNA的表達(dá)沒有顯著變化。沉默GLUT4后ITLN1處理的成熟脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取量顯著降低。這表明ITLN1通過上調(diào)GLUT4來增加脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取，從而抑制OC的生長。

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中死亡率最高的疾病。卵巢癌早期癥狀不明顯，約65%的患者確診時已處于晚期，死亡率較高。早期診斷者5年生存率可達(dá)92%，但是臨床上僅有15%的患者在此階段被確診。由此可見卵巢癌的生存率有賴于早期的診斷和治療，卵巢癌生物標(biāo)志物具有采樣簡單、操作方便等多方面的特點(diǎn)，被認(rèn)為是理想的早期診斷指標(biāo)和預(yù)后跟蹤指標(biāo)。

云克隆提供卵巢癌生物學(xué)標(biāo)志物相關(guān)的多種指標(biāo)蛋白、抗體以及ELISA試劑盒產(chǎn)品，廣泛的應(yīng)用于人、小鼠、大鼠、豬、羊等多個物種的檢測。

裸鼠成瘤模型

皮下成瘤

動物品系：SPF 級無胸腺 Balb/C-nude 裸鼠，雄性，周齡為 4-5W，體重為 15-20g

建模方法：將標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的 HepG2 細(xì)胞消化、離心，將所得的約 5×10^6個細(xì)胞溶于 0.1 mL DMEM 培養(yǎng)液，注射于裸鼠右側(cè)背部皮下。

肝臟原位成瘤

動物品系：SPF 級胸腺 Balb/C 裸鼠，周齡為 4-6W，體重為 15-20g

建模方法：將標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的 HepG2-luc 細(xì)胞消化、離心，將所得的約 5×10^6個細(xì)胞溶于 0.1 mL DMEM 培養(yǎng)液待用。麻醉小鼠，待麻醉生效后，開腹暴露肝臟，用 1ml胰島素注射針取準(zhǔn)備好的細(xì)胞注射于裸鼠肝臟內(nèi)，用 5-0 絲線縫合傷口，活力碘消毒傷口，將裸鼠放在加熱墊上，待清醒后正常飲食飼養(yǎng)?；铙w成像檢測：在成瘤后對裸鼠進(jìn)行熒光活體成像檢測，成像前麻醉小鼠，再通過腹腔注射 3mg 底物 luciferin，底物注射 10 分鐘后進(jìn)行熒光活體成像檢測。圖 1 為裸鼠 HepG2-luc 細(xì)胞肝臟原位注射 1 周后熒光活體成像圖。