2020年7月29日，來(lái)自中山大學(xué)中山眼科中心，國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的Wei Chi教授在“The Ocular Surface”發(fā)表了題為“NLRP12- and NLRC4-mediated corneal epithelial pyroptosis is driven by GSDMD cleavage accompanied by IL-33 processing in dry eye”的文章。研究發(fā)現(xiàn)一種與NLRP12和NLRC4相關(guān)的炎癥誘導(dǎo)、消皮素D依賴并伴有IL-33參與的焦亡機(jī)制。這種機(jī)制對(duì)受到環(huán)境影響產(chǎn)生的眼表上皮缺損負(fù)責(zé)。IL-33的處理以及之后擴(kuò)大的炎癥級(jí)聯(lián)必須有消皮素D的參與。這預(yù)示著新的治療靶點(diǎn)的出現(xiàn)。

                                                                                      產(chǎn)品：Gasdermin D蛋白(GSDMD)重組蛋白 

                                                                                      貨號(hào)：RPE529Mu01                                    

                                                                                      來(lái)源：原核表達(dá)                                      

                                                                                      純度：> 95%

研究簡(jiǎn)介：

干眼癥是一種常見(jiàn)的多因素性自身免疫性眼表疾病。干燥（Desiccating stress, DS），高滲透壓等環(huán)境因素會(huì)影響角膜上皮細(xì)胞，從而誘發(fā)眼表炎癥。炎性小體引起的細(xì)胞焦亡是程序性細(xì)胞死亡的一種促炎形式。其以caspase-1/11 (CASP1/11)誘導(dǎo)消皮素D (GSDMD)促進(jìn)細(xì)胞裂解為特征。而GSDMD是膜孔形成、細(xì)胞破裂和促炎細(xì)胞因子釋放所必需的。

為了深入探究干眼引發(fā)的病理分子改變，作者對(duì)DS處理的小鼠角膜上皮細(xì)胞和對(duì)照組進(jìn)行了RNA-Seq。分析結(jié)果表明，DS損傷涉及多個(gè)與炎癥和免疫有關(guān)的通路。因?yàn)楦裳郯Y是自身免疫性疾病，因此作者通過(guò)研究免疫系統(tǒng)過(guò)程途徑，發(fā)現(xiàn)焦亡關(guān)鍵底物GSDMD的表達(dá)在該途徑上調(diào)。并且，與對(duì)照組相比，DS處理的小鼠角膜上皮中的GSDMD水平升高。為探究GSDMD在干眼癥中的作用，作者敲除小鼠的GSDMD基因，發(fā)現(xiàn)在DS處理下，相較于正常小鼠，基因敲除小鼠淚水流失更少。此外，GSDMD基因的缺失減弱了眼表疾病，并導(dǎo)致角膜上皮缺損數(shù)量的減少。作者同樣通過(guò)RNA-Seq篩選到TLR4，并進(jìn)一步探究TLR4和GSDMD之間的調(diào)控機(jī)制。通過(guò)免疫熒光染色分析發(fā)現(xiàn)TLR4基因敲除小鼠中的GSDMD的表達(dá)顯著降低。這些發(fā)現(xiàn)都證明TLR4在GSDMD上游起作用并且與焦亡有關(guān)。

作者在DS處理的小鼠角膜上皮細(xì)胞中檢測(cè)到NLRP12和NLRC4水平的上升。在NLRP12和NLRC4基因敲除小鼠模型中，DS處理的第一天，淚液體積就迅速減少，NLRP12的缺失不僅顯著降低了淚液減少的程度，而且顯著改善了角膜缺損的愈合。這些發(fā)現(xiàn)表明，NLRP12和NLRC4作為促炎觸發(fā)器，在干眼癥發(fā)展過(guò)程中調(diào)節(jié)眼表疾病。通過(guò)qRT-PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)敲除NLRP12后NLRC4蛋白和mRNA水平顯著降低，敲除NLRC4后NLRP12蛋白和mRNA水平顯著降低。并且，NLRP12或NLRC4的敲除可顯著阻斷CASP1、IL-1和GSDMD的裂解，角膜上皮中的GSDMD顯著降低，證實(shí)NLRP12和NLRC4誘發(fā)了干眼癥中GSDMD依賴的焦亡。之后，作者使用YVAD抑制CASP1活性，抑制了IL-1β的生物活性以及N端的GSDMD生成，而重組CASP1蛋白的加入則相反地促進(jìn)了IL-1蛋白和GSDMD的裂解。這些結(jié)果證實(shí)了NLRP12和NLRC4炎性小體在干眼癥中相互調(diào)節(jié)并依賴CASP1誘導(dǎo)的GSDMD裂解促進(jìn)焦亡作用。

作者假設(shè)NLRP12和NLRC4炎性體的激活可能參與了TLR4介導(dǎo)的焦亡。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)和體外，消除TLR4顯著降低了NLRP12和NLRC4在蛋白和mRNA水平的表達(dá)。同時(shí)，免疫熒光染色檢測(cè)到TLR4敲除小鼠角膜上皮中NLRP12或NLRC4的表達(dá)顯著降低，并且NLRP12/NLRC4炎性體相關(guān)蛋白水平以及下游CASP1蛋白水解作用顯著降低。因?yàn)镃ASP8是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)子，作者發(fā)現(xiàn)體內(nèi)TLR4的異位缺失或體外敲低TLR4可明顯抑制CASP8的激活。在CASP8敲除的小鼠中，眼表?yè)p傷減少，淚液明顯增多，并且抑制了NLRP12和 NLRC4炎性小體體內(nèi)體外活性。這都表明CASP8對(duì)DS引起的眼表疾病的惡化負(fù)一定的責(zé)任。

之后，作者為了探究IL-33在焦亡時(shí)的功能和機(jī)制，將重組IL-33蛋白和抗體分別應(yīng)用于角膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與DS組相比，重組IL-33蛋白組淚液生成明顯減少，角膜缺損增加。并且，作者發(fā)現(xiàn)在GSDMD敲除小鼠中IL-33對(duì)角膜上皮的處理顯著減少。在恢復(fù)GSDMD敲除小鼠的GSDMD的水平后，IL-33d的水平也明顯上升。并且，NLRP12或NLRC4敲除和藥劑阻礙CASP1小鼠的IL-33生物活性水平均下降。這都說(shuō)明GSDMD引起的焦亡能刺激IL-33的合成。

自身免疫（autoimmunity）是在正常情況下，動(dòng)物的免疫系統(tǒng)只對(duì)自身以外的異物抗原發(fā)生反應(yīng)，但由于某些原因?qū)ψ陨順?gòu)成成分引起免疫反應(yīng)時(shí)，則稱為自身免疫。自身免疫在哺乳動(dòng)物中廣泛存在，在正常條件下被視為機(jī)體正常防御的一部分，但是一旦自身免疫出現(xiàn)紊亂，便可以致病，出現(xiàn)自身免疫性疾病，比如：系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎以及自身免疫性溶血等?，F(xiàn)在一般認(rèn)為自身免疫疾病的發(fā)病是個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，涉及面較廣，與遺傳、病毒感染、免疫功能狀況等密切相關(guān)，而抑制性T細(xì)胞功能降低及有免疫原性的自身抗原形成是其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。

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