2020年 9月 28日，來自華南農(nóng)業(yè)大學的 Jinding Chen教授在 Autophagy上在線發(fā)表了題為“LDHB inhibition induces mitophagy and facilitates the progression of CSFV infection”的文章。該論文發(fā)現(xiàn)了 LDHB調(diào)控CSFV感染的新機制。

在 這 篇 文 章 中，云 克 隆 多 克 隆 抗 體（乳 酸 脫 氫 酶 B（Lactate Dehydrogenase B, LDHB）Polyclonal Antibody，PAB698Hu01）再次受到科研工作者的認可，榮登優(yōu)秀國際期刊。

研究介紹

       豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）是豬瘟的病原，它會引起仔豬出血綜合征、高熱以及器官損傷。CSFV是很小的折疊的單鏈正義 RNA病毒，它可以感染多種類型的細胞。人乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase, LDH）作為糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，具有兩種分型：LDHA和 LDHB。許多研究表明，LDHB不僅在腫瘤細胞的代謝中起到了重要作用，同時被視為癌癥標志物。并且，有證據(jù)表明 LDHB定位在線粒體中，參與多種關(guān)鍵細胞過程，包括 ATP的產(chǎn)生、凋亡、鈣穩(wěn)態(tài)、細胞增殖以及核苷酸和脂質(zhì)合成。 

       多種內(nèi)在和外在刺激引起線粒體的分裂與融合，并誘導線粒體自噬。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，CSFV誘導線粒體自噬作為一種抑制細胞凋亡的手段，有效促進病毒持續(xù)感染。此外，有報道稱糖酵解是腫瘤、肝臟疾病和糖尿病等疾病模型中線粒體代謝的主要能量來源。同時，乳酸參與培養(yǎng)的 CHO細胞和 LDHB定位于線粒體的線粒體。基于這些結(jié)果，作者推測 LDHB可能對線粒體自噬產(chǎn)生影響。 

       為了探究感染 CSFV對乳酸和丙酮酸代謝的影響，作者用 CSFV侵染巴納豬后觀察-2、0、2、4、6、8天的乳酸和丙酮酸水平。結(jié)果表明，乳酸含量上升的同時丙酮酸含量下降。在體外多重感染 PG-15細胞也得到相同的結(jié)果。作者為進一步探究 LDHB是否參與此過程，在 CSFV感染前 24h轉(zhuǎn)染 PK-15細胞的 LDHB RNAi，發(fā)現(xiàn)感染后 48h丙酮酸濃度上升，乳酸濃度沒有變化。這一結(jié)果表明 CSFV感染通過 LDHB影響 PG-15細胞的乳酸和丙酮酸的代謝。 

       在之前的研究中，作者發(fā)現(xiàn) LDHB是 CSFV N53蛋白的結(jié)合元件之一，在 CSFV復制中起到關(guān)鍵作用。作者分別轉(zhuǎn)染了缺少 LDHB不同結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒和 HA-NS3質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn) LDHB抑制 NS3的表達，同時 NS3也同樣抑制 CSFV感染的PK-15和 3D4/2細胞中的 LDHB表達。 

       因為 LDHB定位在線粒體膜上，而線粒體自噬在 CSFV感染中起到關(guān)鍵作用，因此作者猜測 LDHB通過線粒體來影響 CSFV。于是，作者沉默了 LDHB，然后通過透射電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體形態(tài)和長度的變化。透射電鏡圖像顯示，與對照組相比，沉默 LDHB的細胞的線粒體嵴明顯減少。定量分析顯示沉默 LDHB的細胞中自噬體樣結(jié)構(gòu)數(shù)量顯著增加。激光共聚焦顯微鏡觀察到先例體變短并且分裂增加。線粒體自噬往往會引起線粒體質(zhì)量的減少。作者使用 3-MA處理 PK-15細胞，發(fā)現(xiàn) 3-MA逆轉(zhuǎn)了沉默 LDHB的線粒體蛋白降解。并且，作者發(fā)現(xiàn)沉默 LDHB會提高MFN2泛素化。作者進一步使用串聯(lián)質(zhì)譜標簽 mRFP-EGFP轉(zhuǎn)染 PK-15和 3D4/2細胞，發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染 siNC的細胞呈現(xiàn)黃色熒光相比，轉(zhuǎn)染了 siLDHB的 PK-15和 3D4/2細胞呈現(xiàn)更多的紅色熒光，表明線粒體被溶酶體降解。這些結(jié)果表明，抑制 LDHB可誘導線粒體分裂和線粒體自噬。 

       作者使用 NFKB，IRF3和 IFNB雙熒光報告基因，發(fā)現(xiàn)抑制 LDHB提高了 NFKB的轉(zhuǎn)錄活性，而超量表達 LDHB則減少了 NFKB的相對熒光。這些結(jié)果表明抑制 LDHB對 NFKB信號通路有正面影響。當作者感染 CSFV細胞時，siLDHB對NFKB信號的激活消失，細胞因子表達下降。這說明 siLDHB促進了 NFKB信號通路的激活，而 CSFV感染抑制了 NFKB信號通路的激活。 

       之后，作者開始驗證 LDHB對 NFKB信號的抑制作用是否通過線粒體自噬調(diào)節(jié)。對細胞進行 shPRKN，shRNA空載，siLDHB的轉(zhuǎn)染。結(jié)果顯示 shPARK2可以抑制線粒體自噬，減少 NFKB信號通路上的蛋白表達量。這意味著 LDHB通過線粒體自噬途徑調(diào)控 NFKB信號通路。同時，作者通過敲除 LDHB蛋白和超量表達 LDHB，發(fā)現(xiàn)抑制 LDHB可以促進CSFV的復制，而過表達 LDHB則會降低 CSFV的復制。檢測 CSFV感染 24h后細胞上清中的 CSFV mRNA和病毒滴度后發(fā)現(xiàn)，它們在敲除 LDHB的細胞中含量上升，而在超量表達 LDHB的細胞中含量下降。這些結(jié)果表明 LDHB對 CSFV復制有著負面的影響。作者使用線粒體自噬的拮抗劑 CCCP、干擾質(zhì)粒 shPRKN和 NFKB信號通路抑制劑 BAY處理 PK-15和3D4/2細胞，在感染 CSFV24h后病毒基因復制和 Npro蛋白表達缺失。這說明 LDHB通過細胞自噬通路和 NFKB信號通路來抑制 CSFV的復制。細胞的存活率并不受 RNAi影響。

細胞自噬 

細胞自噬（autophagy）是一個吞噬自身細胞質(zhì)蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，藉此實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。自噬在機體的生理和病理過程中都能見到，其所起的作用是正面還是負面的尚未完全闡明，例如：細胞在饑餓過程中會啟動自噬，但是也與許多病理過程相關(guān)比，如發(fā)育、分化、神經(jīng)退行性疾病、應激、感染以及癌癥。mTOR激酶是誘導自噬的重要調(diào)節(jié)分子，通過 mTOR激活 Akt和 MAPK信號轉(zhuǎn)導可以抑制自噬，而激活 AMPK和 p53信號轉(zhuǎn)導則會促進自噬。在哺乳動物細胞中 ULK1、ULK2、UKL3最為 mTOR的下游，會激活自噬發(fā)生的重要復合體 PI3K形成，促進 LC3-I和LC3-II形成，調(diào)控自噬的發(fā)生。綜合目前研究發(fā)現(xiàn)，LC3-II、Beclin-1和 P62均可作為自噬發(fā)生檢測的標志物。

Figure 1. The autophagic process. (Michelle Cicchini, 2014)Upon deprivation of nutrients or growth factors, activation of AMPK and/or inhibition of mTOR lead to activation of ULK, which phosphorylates Beclin-1, leading to VPS34 activation and phagophore formation. ULK functions in a complex with FIP200 and ATG13, whereas VPS34 function requires are gulatory subunit, VPS15(p150), and Beclin-1, which further mediates the association of other regulatory factors such as AMBRA, ATG14, UVRAG, and BIF1. Multiple ATG proteins such as ATG5 and ATG7 constitute two "ubiquitin-like conjugation systems" that catalyze the formation of phosphatidylethanolamine (PE)-conjugated LC3 (LC3-II) and direct its proper incorporation into the phagophore membrane, where it serves as docking site of adaptor proteins (and bound cargos). The closure of an elongated phagophore marks the formation of a mature autophagosome, which eventually fuses with a lysosome, leading to cargo degradation and recycling of nutrients and metabolites.

    云克隆提供細胞自噬相關(guān)的 120種指標蛋白、抗體以及 ELISA試劑盒產(chǎn)品，廣泛的應用于人、小鼠、大鼠、豬、羊等多個物種的檢測。目前客戶使用云克隆細胞自噬相關(guān)指標產(chǎn)品發(fā)表的 SCI文獻已超過400篇。