2020年 11月 13日，來自武漢大學(xué)宋保亮教授及其團(tuán)隊(duì)在國際頂級期刊 Nature上在線發(fā)表了題為“Feeding induces cholesterol biosynthesis via the mTORC1–USP20–HMGCR axis”的文章。該文章揭示了膽固醇合成調(diào)控的新機(jī)制。膽固醇合成途徑中的限速酶羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）在進(jìn)食后顯著上調(diào)，其中去泛素化酶泛素特異性肽酶20（USP20）磷酸化修飾扮演了重要角色。在這篇文章中，云克隆 8個 ELISA試劑盒受到科研工作者的認(rèn)可，榮登國際頂級期刊，為科研助力！

研究介紹 

       膽固醇有多種生理功能，但膽固醇升高往往存在患多種疾病的風(fēng)險(xiǎn)，如心血管疾病、糖尿病等。從乙酰輔酶 A（acetyl-CoA）到膽固醇的合成需要經(jīng)過 30個步驟。其中，3-羥基 -3甲基戊二酰輔酶 A還原酶（HMGCR）是膽固醇合成中的限速酶，嚴(yán)格控制膽固醇的生物合成，以防止膽固醇過量損傷機(jī)體。這一調(diào)控主要通過兩個負(fù)反饋途徑：一是固醇誘導(dǎo) HMGCR降解；二是固醇調(diào)控固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBPs）以控制膽固醇合成基因的轉(zhuǎn)錄。在演化過程中，機(jī)體適應(yīng)了不穩(wěn)定的食物供應(yīng)環(huán)境。膽固醇的生物合成在禁食（fasting）時受到抑制，在進(jìn)食（feeding）時增加。然而，其中的分子機(jī)制并不清晰。 

       為探究膽固醇合成在不同條件下的分子機(jī)制，作者首先檢測了肝臟中 HMGCR、法尼基二磷酸法尼基轉(zhuǎn)移酶（FDFT1）、羊毛固醇合成酶（LSS）以及 24-脫氧膽固醇還原酶（DHCR24）的表達(dá)情況。在夜間禁食后，給小鼠喂食高蔗糖、低脂肪、低膽固醇的食物，以消除反饋調(diào)節(jié)的干擾。再投喂后，HMGCR蛋白水平提高約 20倍，而 FDFT1、LSS和 DHCR24蛋白水平提高不到 1倍。編碼這些蛋白的 mRNA增加了 2-4倍。這表明喂食后 HMGCR蛋白不僅轉(zhuǎn)錄水平提高，而且還涉及到轉(zhuǎn)錄后修飾。 

       之前的研究表明，固醇升高會引起 HMGCR降解。于是作者進(jìn)行體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來評估這一機(jī)制是否在禁食和重新進(jìn)食的條件下依然奏效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，禁食的小鼠中 HMGCR泛素化比再進(jìn)食的小鼠要高得多。作者提出了兩種可能：一是禁食小鼠存在能提高 E3活性的因素；二是再進(jìn)食小鼠有更高的去泛素化酶（DUB）活性。之后，將 CHO-7細(xì)胞分別進(jìn)行 25-HC（刺激 HMGCR泛素化）和 MG132（阻止蛋白降解）處理，然后用肝細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)免疫沉淀。結(jié)果表明，HMGVR泛素化在禁食肝細(xì)胞基質(zhì)中沒有變化，但在再進(jìn)食的肝細(xì)胞基質(zhì)中顯著下降。這些結(jié)果表明，再進(jìn)食的小鼠肝臟中 DUB活性較高，以保護(hù) HMGCR蛋白免受泛素化降解。

       作者篩選出唯一能作為 HMGCR降解阻斷劑的 USP20。使用 USP20抑制劑 GSK2643943A會增加 HMGCR泛素化，沉默USP20會加速 HMGCR的降解。因?yàn)?USP20在肝中高表達(dá)，因此作者使用了肝中特異性缺乏 USP20小鼠（L-Usp20-/-）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。L-Usp20-/-小鼠再進(jìn)食后肝中的 HMGCR蛋白含量沒有變化，而野生型小鼠 HMGCR含量顯著上升。野生型小鼠再進(jìn)食后肝臟中膽固醇合成增加了 12.4倍，但 L-Usp20-/-小鼠肝臟中，這一效應(yīng)降低了 45%。這些結(jié)果都表明 USP20是響應(yīng)進(jìn)食的肝 HMGCR去泛素化酶。值得注意的是，L-Usp20-/-小鼠的循環(huán)脂質(zhì)和葡萄糖水平顯著低于野生型。于是作者將野生型小鼠禁食后注射葡萄糖或胰島素，發(fā)現(xiàn)肝臟中 HMGCR表達(dá)與葡萄糖和胰島素協(xié)同升高，而USP20水平不變。同樣，在野生型肝細(xì)胞中，胰島素和葡萄糖提高了 HMGCR蛋白水平，但在 Usp20缺陷型肝細(xì)胞中沒有。胰島素級聯(lián)包括 P13K、AKT和 mTOR。它們的抑制劑都可以阻止 USP20介導(dǎo)的 HMGCR積累?？梢栽诘脱菚r抑制 mTORC1活性的 AMPK，其抑制劑可以通過 USP20恢復(fù) HMGCR穩(wěn)定。這些結(jié)果都意味著 USP20可能對 mTORC1下游的胰島素和葡萄糖響應(yīng)。 

       定量質(zhì)譜鑒定了集中 USP20磷酸化肽。僅在高糖條件下檢測到 Ser132和 Ser134位點(diǎn)磷酸化，這與之前報(bào)道的mTORC1磷酸化蛋白組學(xué)的結(jié)果相同。作者通過實(shí)驗(yàn)通過胰島素和葡萄糖信號通路調(diào)節(jié) USP20的模型：進(jìn)食誘導(dǎo)的胰島素和葡萄糖信號通路激活 mTORC1，使 USP20在 S132和 S134位點(diǎn)磷酸化。磷酸化的 USP20然后與 gp78結(jié)合，通過去泛素化穩(wěn)定 HMGCR，從而增加肝臟中膽固醇的生物合成。

       為了進(jìn)一步了解 USP20在代謝疾病中的作用，作者對小鼠進(jìn)行高糖高脂（HFHS）喂養(yǎng)。與野生型小鼠相比，L-Usp20-/-小鼠體重增加少，在肝臟和脂肪組織中脂肪堆積更少，膽固醇和甘油三酯水平更低，并且胰島素敏感性和葡萄糖清除率顯著提高。與鼠糧相比，慢性 HFHS飲食增加了 AKT-mTORC1信號，降低了 AMPK活性。在野生型小鼠中，USP20在 S132和 S134位點(diǎn)的磷酸化顯著增加，HMGCR水平升高，而 HFHS的 L-Usp20-/-小鼠則沒有。這些結(jié)果表明，長期食用 HFHS可長期激活 mTORC1，通過磷酸化 USP20提高 HMGCR水平，加重代謝性疾病。不僅如此，肝缺乏 Usp20使 HMGCR降低，HMGCR的降低促使琥珀酸鹽增加，進(jìn)而刺激生熱。 

       此外，USP20抑制劑 GSK2643943A通過抑制肝臟 USP20和 HMGCR不穩(wěn)定可以改善代謝性疾病。GSK2643943A治療降低了血脂含量，改善了葡萄糖清除率，增加了琥珀酸鹽水平和能量，降低了約 50%的膽固醇生物合成。