在進(jìn)行生物藥物分析、抗體制備及蛋白功能研究等實(shí)驗(yàn)時(shí)，重組蛋白無(wú)疑是不可或缺的實(shí)驗(yàn)工具。不合適的重組蛋白浪費(fèi)實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)不說(shuō)還耽誤科研進(jìn)度。重組蛋白如何選擇呢？別著急，貼心的小云整理了一些挑選重組蛋白的竅門(mén)，以幫助科研工作者們從容應(yīng)對(duì)各類(lèi)蛋白實(shí)驗(yàn)。 不同的實(shí)驗(yàn)類(lèi)型，對(duì)于蛋白性能的要求也不同。根據(jù)實(shí)驗(yàn)類(lèi)型，選擇性能合適的重組蛋白，輕松獲得完美的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 01 生物藥物分析-SPR實(shí)驗(yàn) 最近，常常有客戶(hù)訂購(gòu)重組蛋白用于表面等離子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）實(shí)驗(yàn)。SPR技術(shù)是基于芯片表面折射率變化的新型光學(xué)檢測(cè)技術(shù)，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)生物分子間相互作用，包括DNA與蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)分子之間、藥物與蛋白之間、核酸與核酸之間、抗原與抗體之間以及受體與配體等生物分子之間的相互作用。生物分子間結(jié)合/解離引起生物傳感器表面質(zhì)量的增加/降低，折射率會(huì)隨之變化，因而通過(guò)分析反應(yīng)過(guò)程中SPR角度的動(dòng)態(tài)變化可獲取生物分子間互作的特異信號(hào)。憑借著靈敏度高、準(zhǔn)確性好、穩(wěn)定性高以及重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，SPR技術(shù)成為近年來(lái)最為熱門(mén)的生物藥物分析檢測(cè)技術(shù)之一。以最為常用的CM5傳感芯片（羧基化的葡聚糖芯片）為例，配體蛋白以氨基偶聯(lián)的方式結(jié)合到芯片上，選購(gòu)配體蛋白的小tips如下: 1）高純度（不低于90%的純度）。高純度的蛋白可防止非特異性結(jié)合，有效避免因非特異性結(jié)合而干擾互作反應(yīng)分析結(jié)果。 2）濃度高，可達(dá)到1mg/mL。 3）明確的等電點(diǎn)信息。芯片偶聯(lián)需將蛋白溶解于pH低于蛋白pI的溶液中，使蛋白表面的凈電荷為正，在流經(jīng)芯片表面時(shí)，可以通過(guò)靜電吸附作用結(jié)合到芯片表面的羧基（電荷為負(fù)）上。過(guò)低的pH會(huì)影響蛋白的活性，因此我們應(yīng)用預(yù)富集實(shí)驗(yàn)，尋找最適合的pH條件。 4）明確的分子量信息。偶聯(lián)量的計(jì)算需要了解配體與分析物的分子量大小。 5）蛋白buffer不含Tris等含氨基基團(tuán)的試劑。Tris等含氨基基團(tuán)的試劑中有大量游離的氨基，濃度遠(yuǎn)高于蛋白中的氨基，從而使蛋白無(wú)法偶聯(lián)到芯片上。 6）避免沉淀。 02 抗體制備 重組蛋白是一種最為常用的免疫原。將重組蛋白免疫動(dòng)物，可產(chǎn)生并獲得抗體。當(dāng)制備抗體時(shí)，選用重組蛋白需要注意以下方面： 1）選用純度高的蛋白。蛋白純度越高，非目的性的免疫性反應(yīng)就越小，目的抗體在血清中所占的比例就越高，更易制備獲得高性能的抗目的蛋白的特異性抗體。 2）選用去標(biāo)簽或僅帶His蛋白標(biāo)簽的重組蛋白。為了便于純化蛋白，重組蛋白通常會(huì)帶一段標(biāo)簽（如：6His、GST、Myc、MBP、Flag、Fc等）。當(dāng)標(biāo)簽分子量太大，免疫動(dòng)物在產(chǎn)生目標(biāo)蛋白抗體的同時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生標(biāo)簽抗體，影響抗體的特異性。而6His免疫原性弱，產(chǎn)生抗體的幾率非常小，免疫動(dòng)物時(shí)可以不用去掉標(biāo)簽。 3）選用市場(chǎng)上已有的商業(yè)化重組蛋白產(chǎn)品，且這些產(chǎn)品已被用于抗體制備并有對(duì)應(yīng)的商業(yè)化抗體產(chǎn)品面市。這類(lèi)重組蛋白產(chǎn)品可直接選用，節(jié)省時(shí)間和精力。 03 蛋白功能研究 蛋白質(zhì)具有各種各樣的生物功能，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)。如何選擇蛋白產(chǎn)品，用于蛋白功能研究呢？ 1）蛋白序列。建議選擇全長(zhǎng)重組蛋白或者含有功能區(qū)域的蛋白片段。蛋白序列及功能區(qū)域序列信息可在uniprot相應(yīng)網(wǎng)頁(yè)中找到。 2）生物學(xué)功能的驗(yàn)證數(shù)據(jù)。選擇重組蛋白產(chǎn)品用于生物功能研究時(shí)，最為關(guān)鍵的在于了解蛋白產(chǎn)品對(duì)應(yīng)生物學(xué)功能的驗(yàn)證數(shù)據(jù)。選購(gòu)前，可在產(chǎn)品頁(yè)面或產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中了解詳細(xì)的驗(yàn)證情況。下面以幾種蛋白生物功能為例，一起來(lái)看看吧。 ① 促細(xì)胞增殖活性 以云克隆活性蛋白產(chǎn)品APA073Hu61 （Active Interleukin 2）為例，將CTLL-2細(xì)胞以5000個(gè)細(xì)胞每孔的細(xì)胞密度接種到96孔板中，并添加不同濃度的人重組IL2蛋白。孵育48h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞（圖1），用CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（IS087, Cell Counting Kit-8）檢測(cè)細(xì)胞增殖情況（圖2），云克隆IL2活性蛋白可明顯刺激CTLL-2細(xì)胞的增殖。

圖1. IL2刺激后CTLL-2細(xì)胞的增殖 A. CTLL-2細(xì)胞與10ng/mL的IL2共孵育48h；B. CTLL-2細(xì)胞孵育48h。

圖2. CTLL-2細(xì)胞的增殖隨IL2的劑量變化曲線(xiàn) ② 結(jié)合活性 以云克隆活性蛋白產(chǎn)品APB886Hu01 （Active Angiotensin I Converting Enzyme 2）為例，用含有0.01% BSA的PBS（pH 7.4）梯度稀釋ACE2。將100μL樣品移入SP蛋白預(yù)包被酶標(biāo)板中，37℃孵育2h。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌。除去洗液，加入抗ACE2 pAb孵育1h，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗板3次。用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育后，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗板3次。加入底物溶液后，在37℃下孵育15-25min。最后，向孔中加入50μL終止液，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度。ACE2和SP的結(jié)合活性如圖3所示，這種作用呈劑量依賴(lài)性。

圖3. 人ACE2與SP的結(jié)合活性 ③ 趨化作用 以云克隆活性蛋白產(chǎn)品APA087Hu01 （Active Monocyte Chemotactic Protein 1 ）為例，將100uL THP-1細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)小室上室，不同濃度的MCP-1蛋白（25 ng/mL和50 ng/mL）置于培養(yǎng)小室下室，37℃孵育3h，去除濾膜并在倒置顯微鏡下觀察遷移的THP-1細(xì)胞（圖4）并計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)（圖5），統(tǒng)計(jì)MCP-1對(duì)THP-1細(xì)胞的趨化作用。

圖4. MCP-1對(duì)THP-1細(xì)胞的趨化作用

A. 50ng/mL MCP-1蛋白對(duì)THP-1細(xì)胞的趨化作用；B. 25ng/mL MCP-1蛋白對(duì)THP-1細(xì)胞的趨化作用；C.THP-1細(xì)胞對(duì)照。

圖5. MCP-1對(duì)THP-1細(xì)胞的趨化作用統(tǒng)計(jì)圖 ④ 酶活性 100℃煮沸10min使IFNg蛋白變性。將重組蛋白PNGase F用反應(yīng)緩沖液從1000ng/mL開(kāi)始進(jìn)行兩倍稀釋?zhuān)總€(gè)濃度取10μL，再加入10μL變性IFNg蛋白在37℃下反應(yīng)1h，最后在100℃煮沸5min終止反應(yīng)，用SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果（圖6）。在10μL反應(yīng)體系中，37℃條件下，1h從10μg變性IFNg中去除超過(guò)95%的碳水化合物所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位。

圖6. SDS-PAGE檢測(cè)IFNg的去糖基化產(chǎn)物 結(jié)果顯示，37℃條件下，1h從10μg變性IFNg中去除超過(guò)95%的碳水化合物所需的PNGase F為2.5ng。 這份重組蛋白挑選攻略是不是很實(shí)用呢？關(guān)于蛋白產(chǎn)品的選擇，如有更好的建議，歡迎在文末留言區(qū)留下您的精彩留言。