原代細(xì)胞（Primary Cells）是來(lái)源活體組織，經(jīng)過(guò)特定分離方法制備而成的初始細(xì)胞。相比于細(xì)胞系，原代細(xì)胞更多保留了體內(nèi)原始組織的生物學(xué)特征，緊密模擬活體模型，產(chǎn)生更具生理意義的結(jié)果，是疾病研究、藥物研發(fā)和藥物篩選等不可或缺的生物工具。

云克隆經(jīng)過(guò)多年的經(jīng)驗(yàn)積累，反復(fù)摸索，提取制備出可供科研人員實(shí)驗(yàn)研究的一系列原代細(xì)胞。以下，先為大家詳細(xì)介紹2種代表性的原代細(xì)胞的分離制備及不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)：

一、大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞：

1. 消化壓片法制備大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞

1）脫頸法處死2周齡左右大鼠，放入75%的酒精中浸泡消毒5min；

2）快速打開(kāi)大鼠胸腹腔，分離出主動(dòng)脈；

                                                                                                                                 圖1. 大鼠主動(dòng)脈

3）去除血管外附著的其他組織；

4）血管內(nèi)皮翻面；

5）采用消化壓片法處理翻轉(zhuǎn)的血管組織；

6）將主動(dòng)脈剪成小的血管段，加入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；

7）倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。

2. 各階段大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞白光拍照

                                                                                                                                 圖2 （100x）

                                                                                                                                 圖3（100x）                        

                                                                                                                                 圖4（200x）

                                                                                                                                 圖5（200x）                         

                                                                                                                                 圖6（100x）

圖2：原代培養(yǎng)第4天的細(xì)胞，組織塊周邊有少量細(xì)胞爬出，貼壁細(xì)胞呈梭形或多邊形；

圖3、圖4：不同倍數(shù)下觀察到原代培養(yǎng)第7天的細(xì)胞，細(xì)胞已長(zhǎng)滿；

圖5：傳代后密度低時(shí)成典型的“網(wǎng)格狀”或“管腔樣”結(jié)構(gòu)；

圖6：傳代后密度高時(shí)的呈現(xiàn)類似鋪路石的密集細(xì)胞群落形態(tài)。

二、兔成骨細(xì)胞

1. 胰蛋白酶-膠原酶混合消化法制備兔成骨細(xì)胞

1）斷頸處死新生48h乳兔，放入75%的酒精中浸泡消毒5 min；

2）無(wú)菌取出兔顱蓋骨，清除骨膜、血管、結(jié)締組織等；

3）將顱蓋骨切成碎塊用胰蛋白酶預(yù)消化；

4）將顱蓋骨用膠原酶處理；

5）鏡下觀察，確定消化處理時(shí)間；

6）收集細(xì)胞懸液，加入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

2. 各階段兔成骨細(xì)胞白光拍照

                                                                                                                                   圖7（100x）                            

                                                                                                                                   圖8（100x）

                                                                                                                                   圖9（100x）                                

                                                                                                                                   圖10（200x）

圖7：原代培養(yǎng)第4天細(xì)胞已有部分貼壁伸展

圖8：原代培養(yǎng)第5天細(xì)胞已長(zhǎng)滿

圖9：傳代后的兔成骨細(xì)胞

圖10：傳代后的兔成骨細(xì)胞

原代細(xì)胞可以更好的模擬體內(nèi)環(huán)境，制備原代細(xì)胞的目的是要用于后期的生物學(xué)研究。那么，原代細(xì)胞就必須要有細(xì)胞本身的一些特性。

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是屬于中胚層的一類多能干細(xì)胞，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富，由于骨髓是其主要來(lái)源，因此統(tǒng)稱為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）。BMSCs具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下具有分化為肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞的能力。

以下，我們來(lái)看下云克隆制備的大鼠BMSCs的成骨和成脂分化能力：

一、原代BMSCs的流式鑒定

BMSCs無(wú)特異性表面標(biāo)志，其表面CD29、CD44、CD90、CD105陽(yáng)性，CD34、CD45陰性。通常選擇兩個(gè)陽(yáng)性標(biāo)記一個(gè)陰性標(biāo)記用于鑒定BMSCs細(xì)胞，我們選用CD29、CD90、CD45 3個(gè)表面標(biāo)記進(jìn)行鑒定，結(jié)果如下：

                                                                                                                                   圖11. BMSCs細(xì)胞流式鑒定

二、原代BMSCs的成骨和成脂分化誘導(dǎo)

1、成骨誘導(dǎo)及鑒定

將第3代BMSCs消化，并制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)滿 90%時(shí)，加入成骨誘導(dǎo)液，每3d換液一次。成骨誘導(dǎo)分化14d 后，分別進(jìn)行茜素紅染色及堿性磷酸酶染色。

                                                                                                                                   圖12. BMSCs成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色  

                                                                                                                                   圖13. BMSCs成骨誘導(dǎo)后堿性磷酸酶染色

2. 成脂誘導(dǎo)及鑒定

將第3代BMSCs消化，并制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)滿 90%時(shí)，加入成脂誘導(dǎo)液A，3d后更換成成脂誘導(dǎo)液B, 2天后更換成成脂誘導(dǎo)液A，3天后更換成成脂誘導(dǎo)液B。如此交替作用2-3輪，鏡下能看到明顯的脂滴，進(jìn)行油紅O染色。

                                                                                                                                  圖14. BMSCs成脂誘導(dǎo)后油紅O染色

云克隆部分原代細(xì)胞展示：