免疫療法已經在黑色素瘤和一些癌癥的治療中得到很好的應用，然而克服治療期間的耐藥性仍然是一個挑戰(zhàn)。2023年1月，Nature雜志上發(fā)表了一篇題為“Targeting TBK1 to overcome resistance to cancer immunotherapy”的文章，在這項研究中，研究者發(fā)現(xiàn)TANK結合激酶1（TBK1）作為一種免疫逃避基因，靶向TBK1可以降低效應細胞因子（腫瘤壞死因子α/干擾素γ，TNFα /IFNγ）的細胞毒性閾值從而增強對程序性死亡受體1（PD-1）阻斷的反應，揭示了TBK1是一種有效的克服癌癥免疫治療耐藥性的新靶點。

研究者通過CRISPR-Cas9敲除獲得Tbk1缺失的小鼠黑色素瘤細胞（B16細胞），Tbk1缺失B16細胞和對照sgRNA B16細胞在植入免疫缺陷小鼠后以相同的速度生長。在攜帶對照和Tbk1缺失B16腫瘤的免疫活性野生型（WT）小鼠中，腫瘤的生長和存活率相當，經抗PD-1處理后，與攜帶sgRNA B16腫瘤的小鼠相比，攜帶Tbk1缺失B16腫瘤小鼠的腫瘤縮小和存活率增加。接著研究人員用藥物處理攜帶B16 -ova（B16腫瘤表達模型抗原卵清蛋白）的腫瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)與單藥處理小鼠或對照小鼠相比，抗PD-1+TBK1i（TBK1抑制劑）處理的小鼠，腫瘤大小得到控制。使用B16-ova小鼠器官型腫瘤球狀體（MDOTS）進行體外分析，結果顯示抗PD-1+TBK1i處理導致細胞活性減少。D4M.3A（具有抗PD-1耐藥性）腫瘤的MDOTS分析顯示，TBK1i在黑色素瘤小鼠中能克服原發(fā)性(內在)耐藥性，同時在B16-ova MDOTS中觀察到類似的結果，該MDOTS來自于體內對PD-1阻斷產生獲得性（繼發(fā)性）抗性的小鼠。這些發(fā)現(xiàn)表明TBK1i +抗PD-1在對PD-1阻斷具有原發(fā)性（內在性）和繼發(fā)性（獲得性）耐藥性的小鼠腫瘤模型中具有活性。(見圖1)

研究者對從黑色素瘤和其他癌癥患者中分離的器官型腫瘤球狀體（PDOTS）進行體外培養(yǎng)。對皮膚黑色素瘤（n=15）、非皮膚黑色素瘤（n=2）和其他癌癥類型（n=13）患者的PDOTS（n=30）的分析顯示，與單藥PD-1阻斷（16.6%）相比，TBK1i（30%）和TBK1i+PD-1阻斷（40%）導致腫瘤生長減少。具有免疫治療耐藥性的轉移性皮膚黑色素瘤患者的PDOTS對TBK1i +抗PD-1聯(lián)合處理敏感，而對體外抗PD-1+/-抗CTLA-4聯(lián)合處理無反應。在結直腸癌（CRC）和其他類型的癌癥中也觀察到PDOTS對TBK1i + PD-1阻斷敏感。(見圖2)

為了檢測TBK1抑制對腫瘤免疫微環(huán)境的影響，研究者對使用抗PD-1、TBK1i或抗PD-1+TBK1i處理的小鼠提取CD45+細胞進行了scRNA-seq檢測，發(fā)現(xiàn)抗PD-1處理增加了T細胞和NK細胞的數量，TBKi +/-抗PD-1處理組髓系細胞顯著擴增。腫瘤浸潤性髓系細胞的亞聚集顯示，M1巨噬細胞的豐度顯著增加，而某些免疫抑制髓系細胞群的豐度減少，包括髓系來源的抑制細胞（MDSCs）。研究人員還發(fā)現(xiàn)在TBK1i+/-抗PD-1處理的小鼠骨髓細胞簇中TNFα（Tnf）和IL-1α（Il1a）大量表達。TBK1i預處理增強了骨髓源性巨噬細胞（BMDMs）中Tnf和Il1a的表達，證實了TBK1抑制對骨髓細胞炎癥反應的直接影響。（見圖3）

研究者對203例轉移性黑色素瘤患者進行免疫檢查點封鎖（ICB）治療，兩組中TNFα和IFNγ水平均升高。接著對接受ICB治療的黑色素瘤患者的單細胞進行轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)NR（無響應）組中TNFα和IFNγ的表達高于R（響應）組。IFNγ在衰竭的CD8 T細胞中表達最高，而TNFα主要在巨噬細胞/單核細胞中富集表達。與單獨使用TNFα或IFNγ相比，TBK1缺失的B16細胞對TNFα/IFNγ聯(lián)合處理表現(xiàn)出明顯的敏感性。用不同濃度的TNFα和IFNγ處理B16細胞，歸一化生長速率抑制（GR）分析顯示，TNFα和IFNγ處理對B16細胞有明顯生長抑制，且在TBK1缺失的B16細胞中觀察到明顯的細胞毒性反應。研究人員發(fā)現(xiàn)隨著TBK1i濃度升高，TNFα/IFNγ處理的B16細胞活力越低。在TNFα和IFNγ處理組，TBK1i也阻止了B16集落的形成。對抗PD-1耐藥性皮膚黑色素瘤和眼部黑色素瘤患者的PDOTS進行評估，結果表明對ICB反應較差的腫瘤通過聯(lián)合給予TBK1i可使其對外源性TNFα/IFNγ敏感。（見圖4）

用TNFα/IFNγ處理Tbk1缺失的B16細胞，研究者觀察到p-RIPK1水平升高。在TNFα/IFNγ刺激后，Nec1（RIPK1抑制劑）和zDEVD-fmk（caspase 3抑制劑）可以阻止Tbk1缺失的B16細胞中細胞活力的喪失。用TNFα/IFNγ體外刺激對照sgRNA和Tbk1 sgRNA B16細胞，發(fā)現(xiàn)在對照細胞和Tbk1缺失細胞中參與IFNγ感應的基因（Ifngr1、Ifgnr2、Jak1、Jak2和Stat1）的sgRNA大量富集。研究者用魯索利替尼(JAK1/2抑制劑)對Tbk1缺失的B16細胞和TBK1i處理的親代B16細胞進行預處理，避免了TNFα/IFNγ介導的細胞死亡。魯索利替尼阻斷了細胞的STAT1磷酸化，消除了Tbk1缺失的B16細胞中RIPK1磷酸化、caspase 8裂解和caspase 3裂解。通過GR分析證實，魯索利替尼將細胞毒反應轉化為細胞靜息反應，恢復了Tbk1缺失的B16細胞的活力。這些數據表明，Tbk1缺失的B16細胞對TNFα/IFNγ敏感性的增強需要IFN傳感，并提供了IFNγ誘導的JAK-STAT信號通路和TNFα介導的RIPK1激活之間的新聯(lián)系。（見圖5）

總的來說，這些發(fā)現(xiàn)證實了TBK1作為一種免疫逃避基因的作用，靶向TBK1可以降低效應細胞因子（TNFα/IFNγ）的細胞毒性閾值從而增強對PD-1阻斷的反應，揭示了TBK1是一種有效的克服癌癥免疫治療耐藥性的新靶點。

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