技術(shù)分享——原代細(xì)胞制備、分離、培養(yǎng)、鑒定
云克隆原代細(xì)胞制備，至今已積累十多年的經(jīng)驗(yàn)，已制備原代細(xì)胞類型包括：軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、各種干細(xì)胞等，制備組織來源包括，如：關(guān)節(jié)、主動脈、心臟、肺、視網(wǎng)膜、大腦、骨髓、腎臟等。云克隆自有動物中心已獲得小動物生產(chǎn)許可證和大、小動物使用許可證，確保我們可提供多種動物來源的原代細(xì)胞，如：大鼠、小鼠、兔、豬、羊、犬、馬等。
圖1. Administrative licenses of Clond-Clone animal center
以下，分享其中幾種有代表性的原代細(xì)胞制備經(jīng)驗(yàn)：
1. 大鼠心肌細(xì)胞（Myocardial Cells，MC）原代細(xì)胞
1）實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)動物：1-3日齡SD乳鼠（雌雄不限）
組織來源：心組織
手術(shù)器材：手術(shù)剪（鑷）、解剖鑷、眼科剪（鑷）
消化酶：膠原酶、胰酶
培養(yǎng)基：DMEM+20%FBS+1%雙抗
2）實(shí)驗(yàn)步驟
? 取剛出生1-3天的乳大鼠，脫頸處死后，放入75%的酒精消毒5min；
? 在超凈臺內(nèi)無菌取出鼠心組織，放入剩有PBS（含2%雙抗）的培養(yǎng)皿內(nèi)，用眼科剪和眼科鑷仔細(xì)清除其中的血塊；
? 用剪刀將組織塊切成肉糜狀；
? 加入胰酶初消化10min后，去除上清；
? 再加入膠原酶消化；
? 1000rpm，5min，收集沉淀，接種細(xì)胞；
? 差速貼壁；
? 換液培養(yǎng)細(xì)胞。
3）相關(guān)數(shù)據(jù)
分離得到大鼠心肌細(xì)胞，進(jìn)行顯微鏡拍照，如下：
圖2. Morphology of Rat Myocardial Cells (Optical microscope, x100)
并能看到心肌細(xì)胞明顯的搏動。
特異性抗體鑒定心肌細(xì)胞，如下：
圖3. IF identification of Actin Alpha 1, Cardiac Muscle (ACTC1) specific antibody (×200)
2. 大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（Trigeminal Ganglion Neuron Cells, TGNC）原代細(xì)胞
1）實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)動物：SD大鼠
組織來源：三叉神經(jīng)節(jié)
手術(shù)器材：手術(shù)剪（鑷）、解剖鑷、眼科剪（鑷）
消化酶：膠原酶、胰酶
培養(yǎng)基：DMEM/F12+10%FBS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Neurobasal A+ B27 神經(jīng)元專用培養(yǎng)基
DMEM/F12
2）實(shí)驗(yàn)步驟
? 脫頸法處死周齡大鼠（2周左右），放入75%的酒精中浸泡消毒5min；
? 剔除神經(jīng)節(jié)周圍的血管、脂肪、神經(jīng)鞘膜等結(jié)締組織，準(zhǔn)確分離三叉神經(jīng)節(jié)；
? 用直剪將神經(jīng)節(jié)剪成小的組織塊，并加入膠原酶、胰酶分布消化；
? 過濾，離心，接種并培養(yǎng)細(xì)胞；
? 換神經(jīng)元專用培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。
3）相關(guān)數(shù)據(jù)
原代培養(yǎng)第4天，可見大部分貼壁伸展神經(jīng)元細(xì)胞，如下：
圖4. Morphology of Rat TGNC primary culture in day 4 (×200)
細(xì)胞換液，繼續(xù)培養(yǎng)2天，即原代培養(yǎng)6天，隨時(shí)間增加，突起變長并交錯(cuò)呈網(wǎng)絡(luò)，如下：
圖5. Morphology of Rat TGNC primary culture in day 6 (×200)
特異性抗體鑒定三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，如下：
圖6. IF identification of β-Tubulin III specific antibody (×200)
3. 小鼠腎皮質(zhì)上皮細(xì)胞（Renal Cortical Epithelial Cells, RCEC）原代細(xì)胞
1）實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)動物：2周齡左右的BALB/C小鼠2只（雌雄不限）
組織來源：腎皮質(zhì)
手術(shù)器材：手術(shù)剪（鑷）、解剖鑷、眼科剪（鑷）
消化酶：膠原酶，胰酶
培養(yǎng)基：小鼠腎小管上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基
2）實(shí)驗(yàn)步驟
? 頸椎脫臼法處死小鼠后置于75%酒精，浸泡5min；
? 在超凈臺中無菌取出雙腎并用手術(shù)刀切取腎皮質(zhì)；
? 用膠原酶和胰酶消化；
? 終止消化；
? 過濾，離心，重懸沉淀；
? 加入腎小管上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)。
3）相關(guān)數(shù)據(jù)
原代培養(yǎng)第一天，腎小管節(jié)段折光性好，狀態(tài)佳，純度較高，如下：
圖7. Morphology of Mouse RCEC primary culture in day 1 (x100)
原代培養(yǎng)4天，腎小管節(jié)段消失，有大量上皮細(xì)胞樣長出，呈島嶼狀向四周伸展，如下：
圖8. Morphology of Mouse RCEC primary culture in day 4 (x100)
原代培養(yǎng)第5天，細(xì)胞已長滿，如下：
圖9. Morphology of Mouse RCEC primary culture in day 5 (x100)
傳代后的細(xì)胞生長良好，如下：
圖10. Morphology of Mouse RCEC after passage (x100)
特異性抗體鑒定腎皮質(zhì)上皮細(xì)胞，如下：
圖11. IF identification of Tight Junction Protein 1 (ZO-1) specific antibody (x200)
4. 兔皮下脂肪前體細(xì)胞（Subcutaneous Preadipocytes, SPrAD）原代細(xì)胞
1）實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)動物: 日本大耳白兔
組織來源：腹股溝部及勁背部皮下脂肪
手術(shù)器材：手術(shù)剪（鑷）、解剖鑷、眼科剪（鑷）
消化酶：膠原酶
培養(yǎng)基：DMEM/F12+15%FBS+1%雙抗
2）實(shí)驗(yàn)步驟
? 取日本大耳白兔1只，經(jīng)耳緣靜脈注射空氣處死，在腹部及勁背部噴酒精消毒；
? 取皮下腹股溝部及勁背部脂肪組織；
? 將脂肪組織切成碎塊，加入膠原酶消化；
? 終止消化，離心，留底部沉淀；
? 收集底部沉淀，加入完全培養(yǎng)基重懸，過濾，培養(yǎng)。
3）相關(guān)數(shù)據(jù)
各階段兔皮下脂肪前體細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)如下：
圖12. Morphology of Rabbit SPrAD primary culture in day 2 ( ×100)
圖13. Morphology of Rabbit SPrAD primary culture in day 4 (×100)
傳代后的細(xì)胞生長良好，如下：
圖14. Morphology of Rabbit SPrAD after passage (P1) (x100)
前脂肪細(xì)胞，或稱脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal adipose cell precursors, ADSCs），與其他成體干細(xì)胞一樣，具有自我更新、活力持久及多向分化潛能。在合適的誘導(dǎo)條件下，可向多個(gè)方向進(jìn)行細(xì)胞分化，如上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞等。
我們將分離得到的兔皮下脂肪前體細(xì)胞分別像成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞方向誘導(dǎo)，進(jìn)行其功能方面驗(yàn)證，誘導(dǎo)完成后，染色結(jié)果如下：
圖15. Alizarin red staining of Rabbit SPrAD after osteogenic induction
圖16. Oil red O staining of Rabbit SPrAD after adipogenic induction
部分原代細(xì)胞列表如下：
<table cellspacing="0" height:19px"><td
List time | Product No. | Product Name | Product Name | UOM |
2周 | CSI003Ca01 | 犬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(AC)原代細(xì)胞 | Primary Canine Articular Chondrocytes (AC) | 5X10^5 |
2周 | CSI003Cp01 | 山羊關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(AC)原代細(xì)胞 | Primary Caprine Articular Chondrocytes (AC) | 5X10^5 |
2周 | CSI006Ca01 | 犬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(AEC)原代細(xì)胞 | Primary Canine Aortic Endothelial Cells (AEC) | 5X10^5 |
2周 | CSI007Ca01 | 犬心肌細(xì)胞(MC)原代細(xì)胞 | Primary Canine Myocardial Cells (MC) | 5X10^5 |
2周 | CSI010Ca01 | 犬視網(wǎng)膜星形細(xì)胞(RA)原代細(xì)胞 | Primary Canine Retinal Astrocytes (RA) | 5X10^5 |
2周 | CSI067Ca01 | 犬腎皮層上皮細(xì)胞(RCEC)原代細(xì)胞 | Primary Canine Renal Cortical Epithelial Cells (RCEC) | 5X10^5 |
2周 | CSI011Ca01 | 犬腦星形膠質(zhì)細(xì)胞(BA)原代細(xì)胞 | Primary Canine Brain Astrocytes (BA) | 5X10^5 |
2周 | CSI032Ca01 | 犬皮下脂肪前體細(xì)胞(SPrAD)原代細(xì)胞 | Primary Canine Subcutaneous Preadipocytes (SPrAD) | 5X10^5 |
2周 | CSI034Ca01 | 犬肺成纖維細(xì)胞(PF)原代細(xì)胞 | Primary Canine Pulmonary Fibroblasts (PF) | 5X10^5 |
2周 | CSI061Ca01 | 犬腎小管上皮細(xì)胞(RTEC)原代細(xì)胞 | Primary Canine Renal Tubular Epithelial Cells (RTEC) | 5X10^5 |
2周 | CSI066Ca01 | 犬膀胱基質(zhì)成纖維細(xì)胞(BSF)原代細(xì)胞 | Primary Canine Bladder Stromal Fibroblasts (BSF) | 5X10^5 |
2周 | CSI069Ca01 | 犬氣管上皮細(xì)胞(TEC)原代細(xì)胞 | Primary Canine Tracheal Epithelial Cells (TEC) | 5X10^5 |
2周 | CSI075Ca01 | 犬新生兒表皮角形成細(xì)胞(NEK)原代細(xì)胞 | Primary Canine Neonatal Epidermal Keratinocytes (NEK) | 5X10^5 |
2周 | CSI083Ca01 | 犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)原代細(xì)胞 | Primary Canine Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells (BMMSCs) | 5X10^5 |
2周 | CSI108Ca01 | 犬食管平滑肌細(xì)胞(ESMC)原代細(xì)胞 | Primary Canine Esophageal Smooth Muscle Cells (ESMC) | 5X10^5 |
2周 | CSI094Ca01 | 犬脾成纖維細(xì)胞(SF)原代細(xì)胞 | Primary Canine Splenic Fibroblasts (SF) | 5X10^5 |
2周 | CSI068Ca01 | 犬氣管平滑肌細(xì)胞(TSMC)原代細(xì)胞 | Primary Canine Tracheal Smooth Muscle Cells (TSMC) | 5X10^5 |
2周 | CSI081Ca01 | 犬內(nèi)臟前脂肪細(xì)胞(VPA)原代細(xì)胞 | Primary Canine Visceral Preadipocytes (VPA) | 5X10^5 |
2周 | CSI138Cp01 | 山羊卵巢成纖維細(xì)胞(OF)原代細(xì)胞 | Primary Caprine Ovarian Fibroblasts (OF) | 5X10^5 |
2周 | CSI057Ca01 | 犬骨骼肌細(xì)胞(SkMC)原代細(xì)胞 | Primary Canine Skeletal Muscle Cells (SkMC) | 5X10^5 |
2周 | CSI153Ca01 | 犬主動脈平滑肌細(xì)胞(ASMC)原代細(xì)胞 | Primary Canine Aortic Smooth Muscle Cells (ASMC) | 5X10^5 |
2周 | CSI019Ca01 | 犬角膜上皮細(xì)胞(CEC)原代細(xì)胞 | Primary Canine Corneal Epithelial Cells (CEC) | 5X10^5 |
2周 | CSI114Ca01 | 犬滑膜細(xì)胞(SYC)原代細(xì)胞 | Primary Canine Synovial Cells (SYC) | 5X10^5 |
2周 | CSI164Ca01 | 犬骨髓單核細(xì)胞(BMMC)原代細(xì)胞 | Primary Canine Bone Marrow Mononuclear Cells (BMMC) | 5X10^5 |
2周 | CSI102Ca01 | 犬成骨細(xì)胞(OB)原代細(xì)胞 | Primary Canine Osteoblasts (OB) | 5X10^5 |
2周 | CSI165Ca01 | 犬外周血單核細(xì)胞(PBMC)原代細(xì)胞 | Primary Canine Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) | 5X10^5 |
2周 | CSI003Mu01 | 小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(AC)原代細(xì)胞 | Primary Mouse Articular Chondrocytes (AC) | 5X10^5 |
2周 | CSI003Ra01 | 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(AC)原代細(xì)胞 | Primary Rat Articular Chondrocytes (AC) | 5X10^5 |
2周 | CSI003Rb01 | 兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(AC)原代細(xì)胞 | Primary Rabbit Articular Chondrocytes (AC) | 5X10^5 |
2周 | CSI088Ca01 | 犬新生兒真皮成纖維細(xì)胞(NDF)原代細(xì)胞 | Primary Canine Neonatal Dermal Fibroblasts (NDF) | 5X10^5 |
2周 | CSI006Mu01 | 小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(AEC)原代細(xì)胞 | Primary Mouse Aortic Endothelial Cells (AEC) | 5X10^5 |
2周 | CSI006Ra01 | 大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(AEC)原代細(xì)胞 | Primary Rat Aortic Endothelial Cells (AEC) | 5X10^5 |
2周 | CSI006Rb01 | 兔主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(AEC)原代細(xì)胞 | Primary Rabbit Aortic Endothelial Cells (AEC) | 5X10^5 |
2周 | CSI007Mu01 | 小鼠心肌細(xì)胞(MC)原代細(xì)胞 | Primary Mouse Myocardial Cells (MC) | 5X10^5 |
2周 | CSI007Ra01 | 大鼠心肌細(xì)胞(MC)原代細(xì)胞 | Primary Rat Myocardial Cells (MC) | 5X10^5 |
2周 | CSI007Rb01 | 兔心肌細(xì)胞(MC)原代細(xì)胞 | Primary Rabbit Myocardial Cells (MC) | 5X10^5 |
2周 | CSI010Mu01 | 小鼠視網(wǎng)膜星形細(xì)胞(RA)原代細(xì)胞 | Primary Mouse Retinal Astrocytes (RA) | 5X10^5 |
2周 | CSI010Ra01 | 大鼠視網(wǎng)膜星形細(xì)胞(RA)原代細(xì)胞 | Primary Rat Retinal Astrocytes (RA) | 5X10^5 |
2周 | CSI010Rb01 | 兔視網(wǎng)膜星形細(xì)胞(RA)原代細(xì)胞 | Primary Rabbit Retinal Astrocytes (RA) | 5X10^5 |
2周 | CSI011Mu01 | 小鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞(BA)原代細(xì)胞 | Primary Mouse Brain Astrocytes (BA) | 5X10^5 |
2周 | CSI011Ra01 | 大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞(BA)原代細(xì)胞 | Primary Rat Brain Astrocytes (BA) | 5X10^5 |
2周 | CSI011Rb01 | 兔腦星形膠質(zhì)細(xì)胞(BA)原代細(xì)胞 | Primary Rabbit Brain Astrocytes (BA) | 5X10^5 |
2周 | CSI032Mu01 | 小鼠皮下脂肪前體細(xì)胞(SPrAD)原代細(xì)胞 | Primary Mouse Subcutaneous Preadipocytes (SPrAD) | 5X10^5 |
2周 | CSI032Ra01 | 大鼠皮下脂肪前體細(xì)胞(SPrAD)原代細(xì)胞 | Primary Rat Subcutaneous Preadipocytes (SPrAD) | 5X10^5 |
2周 | CSI032Rb01 | 兔皮下脂肪前體細(xì)胞(SPrAD)原代細(xì)胞 | Primary Rabbit Subcutaneous Preadipocytes (SPrAD) | 5X10^5 |
2周 | CSI034Mu01 | 小鼠肺成纖維細(xì)胞(PF)原代細(xì)胞 | Primary Mouse Pulmonary Fibroblasts (PF) | 5X10^5 |
2周 | CSI034Ra01 | 大鼠肺成纖維細(xì)胞(PF)原代細(xì)胞 | Primary Rat Pulmonary Fibroblasts (PF) | 5X10^5 |
2周 | CSI034Rb01 | 兔肺成纖維細(xì)胞(PF)原代細(xì)胞 | Primary Rabbit Pulmonary Fibroblasts (PF) | 5X10^5 |
2周 | CSI047Mu01 | 小鼠腦膜細(xì)胞(MC)原代細(xì)胞 | Primary Mouse Meningeal Cells (MC) | 5X10^5 |
2周 | CSI047Ra01 | 大鼠腦膜細(xì)胞(MC)原代細(xì)胞 | Primary Rat Meningeal Cells (MC) | 5X10^5 |
2周 | CSI047Rb01 | 兔腦膜細(xì)胞(MC)原代細(xì)胞 | Primary Rabbit Meningeal Cells (MC) | 5X10^5 |
2周 |