眾所周知，T細胞在腫瘤免疫防御體系中發(fā)揮關鍵作用，但由于它的激活往往受到抑制性和刺激性免疫檢查點的控制，因此免疫檢查點分子的表達紊亂會助力癌細胞的免疫逃逸。雖然阻斷PD-L1等抑制性免疫檢查點蛋白是目前大多數癌癥免疫療法的重要靶標，但免疫共刺激信號的缺乏可能會使這些療法收效甚微甚至毫無用處。

CD58是一種共刺激配體，在細胞的抗腫瘤免疫應答中起著至關重要的作用，但控制其表達的機制尚不明朗。近日，發(fā)表在《Cancer Cell》上題為“CMTM6 shapes antitumor T cell response through modulating protein expression of CD58 and PD-L1”的研究發(fā)現，CMTM6可以同時正向調控免疫共刺激因子CD58和免疫共抑制因子PD-L1，進而影響T細胞的抗腫瘤反應。這無疑為新型免疫療法的開發(fā)打開了新思路。

圖1. 研究思路示意圖（圖片源自《Cancer Cell》）

CMTM6在腫瘤細胞中共同調控CD58和PD-L1

前期研究發(fā)現CMTM6是PD-L1的正調節(jié)因子和分子伴侶，基于此作者定量分析了CMTM6缺失和CMTM6正常表達腫瘤細胞的總蛋白質組。發(fā)現在CMTM6缺陷細胞中，除了PD-L1表達降低外，CD58（LFA-3）也顯著下調。

鑒于CD58在抗腫瘤免疫應答中的關鍵作用，作者進行了基于FACS的單倍體遺傳篩選，以系統(tǒng)地鑒定該蛋白的調控者。結果發(fā)現在CD58^low細胞群體中CD58位點的破壞性插入高度富集。此外，鑒定出糖基磷脂酰肌醇（GPI）生物合成途徑的組分和內質網轉位復合物是CD58表達的調節(jié)因子，而CMTM6也是其中最重要的調節(jié)因子之一。

為了驗證這一發(fā)現，作者敲除了HAP1細胞系中的CMTM6。發(fā)現與親代HAP1細胞相比，CMTM6缺陷細胞表面CD58表達降低。此外，在CMTM6缺陷細胞中重新加入CMTM6表達可以恢復CD58的表達。

上述比較蛋白質組學分析和單倍體遺傳篩選均顯示CMTM6是CD58免疫檢查點的正調節(jié)因子。

由于CMTM6先前已被證明維持PD-L1蛋白的表達，綜合上述結果研究者提出了一個大膽假設：共刺激和共抑制免疫檢查點配體的表達由相同的調節(jié)蛋白控制。

為了驗證這一假設，作者在多種癌癥類型的細胞系中進行了CMTM6的缺失和重構，包括8505C甲狀腺癌細胞、A375黑色素瘤細胞和RKO結直腸癌細胞。在A375細胞中，IFNγ誘導PD-L1表達，而CD58表達不受細胞因子暴露的影響。CRISPR-Cas9破壞CMTM6會降低細胞表面CD58和PD-L1的總蛋白水平。相反，CMTM6的重組恢復了兩種免疫檢查點配體的表達。在CD58和PD-L1基礎表達水平較高的8505C和RKO細胞中，CMTM6缺失同時下調了這兩種免疫檢查點配體，而重新引入CMTM6則恢復了這種表型。

圖2. CMTM6在腫瘤細胞中共同調控CD58和PD-L1（圖片源自《Cancer Cell》）

CMTM6維持CD58蛋白的穩(wěn)定性并與之相互作用

為探究CMTM6介導的CD58調控機制，研究者首先比較了CMTM6缺乏和正常表達細胞中CD58的mRNA水平。發(fā)現CMTM6缺失不會降低CD58的RNA轉錄物水平，但會顯著降低細胞表面和總CD58蛋白水平，表明這種調控發(fā)生在轉錄后水平。由于CMTM6包含一個四元跨越的MARVEL（MAL）結構域以及用于囊泡運輸和膜連接的相關蛋白，能促進PD-L1的內吞循環(huán)并保護PDL1免于泛素化。基于此作者推測CMTM6可以通過類似的機制調節(jié)CD58的表達。為了研究這一點，他們用別藻藍蛋白（allophycocyanin, APC）偶聯(lián)CD58特異性抗體標記細胞表面表達的CD58，追蹤和定量APC信號隨時間的變化。分析顯示，在CMTM6缺失的情況下，細胞表面CD58的衰減速度更快。

在真核細胞中，蛋白質降解主要通過蛋白酶體和溶酶體蛋白水解途徑發(fā)生。隨后，研究者們用蛋白酶體或溶酶體酸化抑制劑孵育細胞。發(fā)現兩種抑制劑都延遲了熒光信號的衰減。值得注意的是，溶酶體抑制顯著降低了CMTM6缺陷細胞中CD58的降解率，其水平與CMTM6正常細胞相似。這些結果表明CMTM6保護細胞表面CD58免受溶酶體介導的降解。

由于CMTM6與PDL1和CD58共定位并調節(jié)其穩(wěn)定性，研究者接下來評估了這三種分子之間可能的相互作用。他們用抗CMTM6、抗CD58和抗PD-L1抗體進行了免疫共沉淀和免疫印跡分析。在A375細胞裂解物的抗CMTM6免疫沉淀中，檢測到CD58和PD-L1。同樣，CMTM6也存在于抗CD58和抗PD-L1免疫沉淀中。然而，在抗CD58免疫沉淀中未檢測到PD-L1，反之亦然。因此，表明CD58和PD-L1之間不存在直接的相互作用。隨后，作者又通過細胞表面免疫沉淀實驗來確定CMTM6是否與細胞表面PD-L1和CD58分子相互作用，發(fā)現PD-L1水平在CD58缺失的A375細胞中略有升高。隨著PDL1水平的升高，PD-L1與CMTM6之間的關聯(lián)增加。相比之下，腫瘤細胞中PD-L1的缺失并沒有導致CD58水平或CMTM6/CD58相互作用的明顯增加。

圖3. CMTM6促進細胞表面CD58的穩(wěn)定性并與之互作（圖片源自《Cancer Cell》）

CMTM6和CD58在T細胞激活和T細胞-腫瘤互作中的作用

研究者進一步評估了腫瘤細胞中CMTM6對T細胞激活的影響。他們共培養(yǎng)了由T細胞1（MART-1）抗原負載的腫瘤細胞識別的黑色素瘤抗原和用MART-1特異性T細胞受體轉導的T細胞。在腫瘤識別后，T細胞顯示出激活標記物（CD137、CD69、IL-2和TNF-a）的表達增加。此外，PD-L1阻斷進一步增強了T細胞的活化，而CD58阻斷具有相反的效果。

通過這種共培養(yǎng)模型，他們發(fā)現，與野生型和CMTM6重組的腫瘤細胞相比，和CMTM6敲除的腫瘤細胞孵育顯著降低了T細胞激活標志物（CD137和CD69）和T細胞效應因子（IL-2和TNFa）的表達。同樣，CMTM6缺失導致腫瘤細胞活力顯著增加。

考慮到CMTM6在維持細胞表面CD58和PD-L1表達中的雙重作用，作者試圖確定這兩個在T細胞-腫瘤細胞相互作用中具有相反功能的免疫檢查點的相對重要性。值得注意的是，當CD58和PD-L1同時被阻斷時，在CD2^high和PD-1⁺T細胞群中，單獨阻斷PD-L1所觀察到的T細胞活化增強被完全消除。實際上，PD-L1和CD58的共抑制使CD2^high和CD2^inter T細胞的活化水平低于未處理的對照組，表明CD58阻斷的主導作用。在A375和8505C細胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)中，都觀察到CD58阻斷對T細胞活化的顯著影響。上述數據表明，CD58在抗原特異性T細胞-腫瘤細胞相互作用和對PD-L1阻斷的反應中起著至關重要的作用。

此外，他們還觀察到A375或8505C細胞中CMTM6的缺失導致腫瘤細胞存活率增加。PD-L1抑制增強了T細胞對腫瘤細胞的殺傷，而CD58的抑制則顯著挽救了腫瘤細胞。與CMTM6缺陷細胞相比。CD58敲除消除了CMTM6正常表達細胞和CMTM6缺乏細胞對腫瘤特異性T細胞和PD-L1阻斷的差異反應。相反，當CD58在CMTM6缺陷和CMTM6正常表達的腫瘤細胞中過表達時，這些細胞的活力在與腫瘤反應性T細胞共培養(yǎng)后下降到一個相對穩(wěn)定的水平。這些發(fā)現強調了CD58在抗原特異性T細胞-腫瘤細胞相互作用和PD-L1阻斷反應中的重要作用，CMTM6介導的CD58調控在此背景下發(fā)揮了重要作用。

圖4. CMTM6、CD58和PD-L1對抗原特異性T細胞-腫瘤細胞相互作用的影響

（圖片源自《Cancer Cell》）

CMTM6和CD58在腫瘤細胞中的表達與ICB治療的臨床反應呈正相關

為了研究人類癌癥中CMTM6和CD58表達之間的關系，研究者們使用CMTM6或CD58的抗體對88個黑色素瘤樣本和102個結腸癌樣本進行了免疫組織化學（IHC）分析。結果顯示，CMTM6和CD58在兩種癌癥類型樣本的腫瘤細胞中廣泛分布且大部分重疊表達（4C）。他們觀察到在88個黑素瘤中有77個的CD58染色主要出現在的CMTM6表達區(qū)域。此外，他們對CMTM6和CD58在腫瘤細胞上的蛋白表達水平進行了量化，發(fā)現它們在腫瘤細胞中的表達存在顯著相關性。

為了評估CMTM6和CD58表達與ICB治療反應之間的關系，他們分析了88例晚期黑色素瘤患者的腫瘤活檢。這些患者隨后接受了抗PD-1或抗PD-1/抗CTLA4治療。結果顯示CMTM6或CD58在這些治療組之間的表達無顯著差異。同時，較高水平的CMTM6或CD58表達與對ICB治療的有利反應顯著相關。這些發(fā)現強調了CMTM6介導的CD58調控在人類腫瘤中的相關性，并提示其在調節(jié)對ICB治療的反應中可能起著關鍵作用。

圖5. 腫瘤細胞中CMTM6調控CD58表達以及它們與ICB治療反應之間的關系

（圖片源自《Cancer Cell》）

免疫檢查點通路在TME中經常失調，從而促進癌癥的進一步發(fā)展并造成免疫治療的耐藥性。因此，解碼調節(jié)免疫檢查點分子的分子機制對于理解癌癥中的免疫調節(jié)至關重要，并且可能預測免疫檢查點療法的反應并提供新的治療途徑。

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