顱縫早閉是不同部位的顱縫過早閉合，影響頭顱和腦的正常發(fā)育，在新生兒中的發(fā)病率為0.25‰。目前，顱縫閉鎖的主要治療方法是復(fù)雜的顱骨手術(shù)，經(jīng)常導(dǎo)致年輕患者大量失血。2023年10月，《Cell Stem Cell》雜志上發(fā)表了一篇題為“Skull progenitor cell-driven meningeal lymphatic restoration improves neurocognitive functions in craniosynostosis”的文章，在這項研究中，研究者發(fā)現(xiàn) 顱骨祖細(xì)胞（skull progenitor cells，SPCs）分泌的血管內(nèi)皮生長因子c（VEGF-C）能促進淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（LECs）的生長和遷移，用于激活腦淋巴功能，作為顱縫早閉疾病和神經(jīng)認(rèn)知缺陷的治療策略。

研究者對成年小鼠頭部用有機溶劑透明化器官（uDISCO）處理后進行三維成像（3D），成像顯示突變小鼠中Prox1⁺腦膜淋巴管密度降低。接著用淋巴管內(nèi)皮受體1（LYVE1）結(jié)合Prox1- eGFP小鼠基因特異性標(biāo)記淋巴管，免疫染色結(jié)果證實Twist1^+/-顱縫早閉小鼠（MUT）腦膜淋巴覆蓋率顯著降低。研究人員注射Alexa Fluor 647偶聯(lián)卵清蛋白（OVA-647）后使其流至頸深淋巴結(jié)（dCLNs），2h后測量小鼠dCLNs中該示蹤劑的情況，在MUT小鼠dCLNs切片中OVA-647的含量明顯減少。以及MUT小鼠注射 OVA-647后連續(xù)取腦切片，檢測腦脊液流入情況，研究人員發(fā)現(xiàn)MUT中OVA-647的面積分?jǐn)?shù)顯著降低，表明突變小鼠腦脊液大分子通過血管旁通路的腦內(nèi)流受到影響。研究者將淀粉樣蛋白- β42- 488（Ab42-488）和OVA-647示蹤劑注射到紋狀體（CPu）中，注射1 h后采集全腦標(biāo)本，進行腦序列切片分析，發(fā)現(xiàn)MUT小鼠腦實質(zhì)中保留了大量的Ab42-488和OVA-647，表明MUT小鼠腦膜淋巴血管破裂導(dǎo)致腦實質(zhì)組織液（ISF）大分子外排受損。這些結(jié)果表明，腦縫閉鎖小鼠的腦膜淋巴管受損與腦脊液內(nèi)流和ISF外排缺陷相關(guān)。（見圖1）

研究者在MUT小鼠頭部雙側(cè)植入與可生物降解材料結(jié)合的Gli1⁺ SPCs。這種縫線再生手術(shù)釋放了MUT小鼠的顱內(nèi)高壓，采用再生縫線的Twist1^+/-小鼠（簡稱REG）的ICP顯著降低。結(jié)果表明SPC植入可以降低突變小鼠升高的ICP。通過LYVE1全腦膜染色顯示，在SPC植入后3個月，REG小鼠的淋巴管覆蓋恢復(fù)。與MUT小鼠相比，REG小鼠dCLNs中檢測到OVA-647 腦脊液示蹤劑的含量增加。同時，REG小鼠腦脊液中OVA-647灌注到腦實質(zhì)的量與WT對照組相當(dāng)。Gli1⁺ SPC植入后，MUT小鼠ISF外排恢復(fù)，腦組織中Aβ₄₂-488和OVA-647殘留量明顯減少。因此，在Twist1^+/-小鼠中植入Gli1⁺ SPC可降低ICP和腦膜淋巴缺陷。（見圖2）

通過細(xì)胞實驗研究者發(fā)現(xiàn)SPC-CM（SPC-培養(yǎng)基）可促進LECs細(xì)胞增殖和遷移。免疫染色結(jié)果表明VEGF-C在顱縫合線和腦膜硬腦膜的Gli1⁺ SPCs中高度表達。接著對Prox1-eGFP小鼠進行了體外注射VEGF-C，發(fā)現(xiàn)VEGF-C在體內(nèi)促進腦膜淋巴管細(xì)胞增殖，LYVE1和Prox1-eGFP標(biāo)記的EdU⁺和Ki67⁺的顯著增加。ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，在SPC-CM中檢測到VEGF-C的濃度急劇增加，這表明VEGF-C可以由SPC分泌。WB結(jié)果顯示經(jīng)SPC-CM處理的LECs中VEGF-C的主要受體VEGFR3的表達量顯著增加。另外，SPC-CM處理也顯著增加下游信號分子的表達量。這些結(jié)果表明，SPCs分泌VEGF-C，然后激活相鄰LECs中的VEGFR3信號，促進細(xì)胞增殖和遷移。（見圖3）

腦膜硬腦膜共標(biāo)記染色結(jié)果進一步證實腦膜淋巴管附近的Gli1⁺ SPCs表達高水平的VEGF-C。ELISA結(jié)果顯示與對照組相比MUT小鼠腦膜中VEGF-C的濃度顯著降低。研究人員將AAV1-mVEGF-C（腺相關(guān)病毒血清型1 -mVEGF-C）或AAV1-GFP對照病毒注射到MUT和對照WT小鼠的腦脊液中，讓病毒在腦膜中擴散并完全表達VEGF-C 1個月。用AAV1- VEGF-C處理的MUT小鼠，與對照組相比，VEGF-C處理增加了腦膜淋巴血管的生長，并改善了其功能。在VEGF-C過表達組中，更多的OVA-647 腦脊液示蹤劑引流到dCLNs。這些結(jié)果表明VEGF-C促進腦縫早閉小鼠的腦膜淋巴血管生長及其引流功能。（見圖4）

由前面的實驗，研究者發(fā)現(xiàn)AAV1-VEGF-C處理改善了MUT小鼠腦脊液內(nèi)流缺陷和ISF外排缺陷。接下來，研究者對WT和MUT小鼠注射AAV1-eGFP或AAV1-VEGF-C 1個月后，進行行為分析。三箱社交實驗結(jié)果表明，與對照組相比，AAV1-VEGF-C處理顯著改善了MUT小鼠的社交能力和社會記憶缺陷。新事物實驗表明，AAV1-VEGF-C處理恢復(fù)了MUT小鼠海馬依賴性空間識別缺陷。Rotarod法監(jiān)測運動學(xué)習(xí)行為，AAV1-VEGF-C處理減輕并幾乎完全改善了小鼠的運動學(xué)習(xí)缺陷。綜上所述，這些結(jié)果表明，通過VEGF-C處理激活腦膜淋巴血管，可以有效地改善Twist1^+/-顱縫早閉小鼠的腦液穩(wěn)態(tài)缺陷和神經(jīng)認(rèn)知異常。（見圖5）

總的來說，這些發(fā)現(xiàn)說明VEGF-C在腦膜淋巴的發(fā)育和體內(nèi)平衡中起著至關(guān)重要的作用，通過SPC植入或VEGF-C基因治療促進腦膜淋巴功能恢復(fù)，是治療顱縫早閉的一種有效策略。

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