心臟再生一直以來(lái)都是心血管疾病研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和前沿。動(dòng)物出生后，心肌細(xì)胞的能量代謝就從糖酵解轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸x。與此同時(shí)，大多數(shù)心肌細(xì)胞發(fā)生染色質(zhì)重構(gòu)和退出細(xì)胞周期。這就阻止了心肌細(xì)胞分裂，為成人心臟再生形成了一種天然的屏障。近期，德國(guó)馬克斯·普朗克心肺研究所研究人員在《Nature》上發(fā)表了題為“Inhibition of fatty acid oxidation enables heart regeneration in adult mice”的研究探索了代謝重編程在克服心臟再生障礙中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷脂肪酸氧化能提高心肌細(xì)胞對(duì)缺氧的抵抗力，刺激心肌細(xì)胞增殖，使缺血-再灌注損傷后的心臟再生。

研究人員首先對(duì)成年小鼠的心肌細(xì)胞（cardiomyocytes，CMs）進(jìn)行了RNA測(cè)序（RNA-seq），數(shù)據(jù)分析顯示，在出生后第一周CMs成熟過(guò)程中，糖酵解和細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)的幾個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)水平降低，而與脂肪酸氧化（FAO）和三羧酸循環(huán)（TAC）相關(guān)的基因發(fā)生了上調(diào)。上調(diào)的FAO相關(guān)基因包括肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（Cpt1b）的肌肉特異性亞型，但不包括普遍表達(dá)的Cpt1b亞型，而這一普遍表達(dá)亞型是線粒體攝取脂肪酸以及隨后的FAO所必需的。

為了探索FAO在CMs成熟和增殖中的潛在作用，研究人員構(gòu)建了Cpt1b敲除（Cpt1b^cKO）小鼠模型。觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照小鼠相比，Cpt1b^cKO小鼠的體重（BW）、心臟重量（HW）、HW/BW比值和心臟形態(tài)均未發(fā)生變化。然而，由于心肌的同心生長(zhǎng)模式，10周齡Cpt1b^cKO小鼠的心臟大小、HW和HW/BW比都增加。而且Cpt1b^cKO小鼠心臟中CMs的絕對(duì)數(shù)量增加了一倍。此外，Cpt1b^cKO小鼠的CM表面積相對(duì)適度增加，這表明心肌同時(shí)發(fā)生增生性和肥厚性生長(zhǎng)。形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)顯示，最小CMs（<100μm²）群體顯著增加，表明Cpt1b失活后會(huì)形成新的CMs，中等大小CMs（100~300 μm²）的比例下降，而較大CMs（＞300μm²）的數(shù)量顯著增加，反映了CMs表面積的總體增加。這些數(shù)據(jù)表明，Cpt1b的缺失會(huì)刺激CMs的增殖，而CMs增殖通常在出生一周內(nèi)在小鼠心臟中終止。

圖1. Cpt1b失活誘導(dǎo)CMs增生和肥厚生長(zhǎng) 

（圖片源自《Nature》）

為了研究Cpt1b失活和隨后的CMs增殖是否能夠促進(jìn)心臟再生，研究人員對(duì)Cpt1b^cKO小鼠進(jìn)行了缺血-再灌注（I–R）損傷模型構(gòu)建，該模型與人類冠狀動(dòng)脈阻塞患者進(jìn)行支架重建的情況非常相似。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照動(dòng)物相比，3周后，Cpt1b^cKO小鼠幾乎沒(méi)有I-R誘導(dǎo)的疤痕，盡管在I-R手術(shù)后24h兩個(gè)突變心臟的風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域（AAR）相似。這表明，阻斷FAO獲得的增殖潛力允許先前存在的CMs重新進(jìn)入細(xì)胞周期并有助于心臟再生。同時(shí)，研究者檢測(cè)到Cpt1b^cKO小鼠在I-R損傷24h后，AAR內(nèi)梗死面積減少，而在I-R損傷48h后，Cpt1b^cKO小鼠心臟收縮變強(qiáng)，這表明抑制FAO也可以保護(hù)小鼠免受I-R損傷。組織學(xué)分析顯示，與對(duì)照組相比，Cpt1b^cKO小鼠的纖維瘢痕面積明顯減少。他們還觀察到I-R手術(shù)后4周，心臟功能的恢復(fù)程度幾乎達(dá)到了損傷前的水平，這明確地證明了cpt1b失活促進(jìn)了心臟再生。CM增殖和心臟保護(hù)增強(qiáng)有助于減少FAO缺乏小鼠冠狀動(dòng)脈閉塞后的疤痕形成。

圖2. cpt1b介導(dǎo)的FAO阻斷可防止I-R損傷并使心臟再生

（圖片源自《Nature》）

接下來(lái)，作者探究了FAO的阻斷如何重新編程CMs代謝。代謝通量和海馬實(shí)驗(yàn)表明，長(zhǎng)鏈脂肪酸的利用在Cpt1b^cKO 的CMs中被有效抑制，沒(méi)有觀察到cpt1無(wú)關(guān)的中鏈或短鏈脂肪酸的明顯代償性使用。此外，靶向代謝組學(xué)分析顯示，來(lái)自中鏈和長(zhǎng)鏈脂肪酸的酰基肉毒堿水平在Cpt1b缺陷的CMs中顯著降低，而細(xì)胞內(nèi)游離肉毒堿水平顯著升高。出乎意料的是，細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A水平和TAC的大多數(shù)代謝產(chǎn)物沒(méi)有顯著改變，這表明在缺乏FAO的情況下，CMs會(huì)通過(guò)不同形式產(chǎn)能量。

隨后，作者對(duì)另一個(gè)潛在的能量來(lái)源氨基酸進(jìn)行了檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)與氨基酸轉(zhuǎn)化有關(guān)代謝物的顯著富集，幾種參與TAC的氨基酸中間體表達(dá)水平也顯著增加。同樣，作者發(fā)現(xiàn)在Cpt1b缺陷的CMs中，支鏈氨基酸（BCAA）分解代謝的代謝物水平顯著升高。因此，作者推斷Cpt1b缺陷的CMs中葡萄糖氧化和BCAA分解代謝的增強(qiáng)有效地補(bǔ)償了脂肪酸衍生的乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)的代謝通量受損。

值得注意的是，Cpt1b失活后，CMs中α酮戊二酸（αKG）顯著增加了近20倍。因?yàn)楣劝滨０泛凸劝彼岬臐舛榷紱](méi)有下降，谷氨酰胺和谷氨酸直接轉(zhuǎn)化為αKG似乎不能解釋?duì)罧G的積累。相反，他們觀察到異檸檬酸水平顯著降低，同時(shí)催化異檸檬酸轉(zhuǎn)化為αKG的異檸檬酸脫氫酶IDH1、IDH2和IDH3A水平升高。此外，在Cpt1b缺失的CMs中，將αKG脫氫酶復(fù)合物轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶a的關(guān)鍵組分OGDH的酶活性有所降低。說(shuō)明Cpt1b和αKG積累的失活不影響其他三羧酸循環(huán)的蛋白水平。上述結(jié)果表明，在阻斷FAO后，合成水平的提高和代謝水平的降低協(xié)同作用使αKG在CMs中積累。

圖3. 線粒體脂肪酸輸入受阻引起CMs代謝發(fā)生改變和αKG水平升高

（圖片源自《Nature》）

由于αKG是組蛋白去甲基化酶的重要輔因子。因此，研究人員接著探究了Cpt1b缺陷CMs中αKG的積累是否影響組蛋白甲基化。通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選（FACS）對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行不同組蛋白賴氨酸甲基化修飾的分析顯示，只有H3K4me3水平降低，而其他11種組蛋白賴氨酸甲基化修飾的水平?jīng)]有降低。而在Cpt1b失活后，異染色質(zhì)標(biāo)記物如H3K9me3、H3K27me3和H4K20me2的水平顯著增加，這可能是由于CMs向未成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)變帶來(lái)的次級(jí)效應(yīng)。因此，作者得出結(jié)論，αKG增強(qiáng)了H3K4me3特異性去甲基化酶的活性，最終導(dǎo)致H3K4me3水平的降低。

使用FACS分選的CM核對(duì)H3K4me3進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（Chip-seq）分析以定位H3K4me3調(diào)控變化的基因區(qū)域，發(fā)現(xiàn)在與CM成熟相關(guān)的基因的啟動(dòng)子和基因區(qū)域，H3K4me3富集程度普遍降低，而啟動(dòng)子處的H3K9me3和H3K27me3水平保持不變。這些發(fā)現(xiàn)表明，αKG的積累激活了H3K4me3特異性去甲基化酶，使其在心臟分化和成熟所需的基因內(nèi)清除H3K4me3，從而將Cpt1b缺陷型CM向更不成熟的、具有增殖能力的狀態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)變。

圖4. αKG表達(dá)量升高誘導(dǎo)H3K4me3去甲基化從而降低CM成熟基因表達(dá)水平

（圖片源自《Nature》）

為了證實(shí)αKG的積累是阻止CM成熟和促進(jìn)增殖的關(guān)鍵信號(hào)，研究人員用細(xì)胞滲透性αKG處理P0-1新生小鼠的CMs 4天。觀察到在胎兒新生階段表達(dá)的基因水平顯著升高，而與CM成熟和分化相關(guān)的基因水平降低。另外，用αKG處理也能降低H3K4me3修飾水平，但不影響H3K9和H4K20甲基化。用CPI-455 （αKG依賴性H3K4去甲基化酶KDM5的特異性抑制劑）或細(xì)胞滲透性R2HG （αKG29的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑）治療新生兒CMs，可阻止αKG誘導(dǎo)的細(xì)胞周期活性增強(qiáng)或異檸檬酸脫氫酶Idh3b或Idh3g的過(guò)表達(dá)。KDM5抑制劑CPI-455對(duì)αKG依賴性的藥理學(xué)抑制表明，αKG對(duì)染色質(zhì)和基因表達(dá)的影響是由 KDM5基因家族成員傳遞的。Kdm5b過(guò)表達(dá)證實(shí)了這一假設(shè)，當(dāng)與αKG聯(lián)合處理時(shí)，Kdm5b可顯著降低H3K4me3水平，并顯著增加CM細(xì)胞周期活性。Kdm5b敲低能有效拮抗αKG的促增殖作用，并能完全恢復(fù)αKG處理后降低的H3K4me3水平，從而使與CM成熟相關(guān)的幾個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)量上升。

圖5. αKG積累會(huì)激活KDM5從而減緩CMs的成熟并促進(jìn)CMs增殖 

（圖片源自《Nature》）

總的來(lái)說(shuō)，該研究通過(guò)對(duì)細(xì)胞能量代謝的重編程來(lái)重啟CMs分裂能力，這一發(fā)現(xiàn)具有開(kāi)創(chuàng)性意義，可能為心肌疾病提供全新的療法。

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