2023年9月27日，德國巴特瑙海姆馬克斯·普朗克心肺研究所的研究團隊在《Nature》期刊發(fā)表了題為“Inhibition of fatty acid oxidation enables heart regeneration in adult mice”的文章。該研究表明：抑制小鼠心肌細胞中脂肪酸氧化可提高對缺氧的抵抗力，刺激心肌細胞增殖，從而使缺血-再灌注損傷后的心臟再生。

大部分動物的成體心臟之所以喪失再生能力，主要是因為在出生后不久，大多數(shù)心肌細胞退出細胞周期，肥大性生長。與此同時，心臟的心肌細胞能量代謝從糖酵解轉(zhuǎn)向脂肪酸氧化代謝，因為脂肪酸氧化這種氧化代謝方式產(chǎn)生能量的效率更高。由于高代謝活性，心肌細胞在出生后成熟伴隨著氧化DNA損傷，這也使心肌細胞難以分裂。因此，一旦發(fā)生心肌損傷，原有的心肌組織被瘢痕組織替代，就會導致心臟功能的永久性喪失。

研究團隊希望從能量代謝方式的轉(zhuǎn)變中尋找心臟再生的方法，故構(gòu)建了αMHC-Cre ^pos/+;Cpt1b ^fl/fl小鼠（簡稱Cpt1b ^cKO），該模型中Cpt1b在胚胎階段的心肌細胞中特異性失活，此基因?qū)π∈蟮闹舅嵫趸陵P重要。之后在Cpt1b基因敲除小鼠上構(gòu)建了缺血-再灌注（I-R）損傷模型，誘導小鼠心臟病發(fā)作。這種I-R損傷模型非常接近于病人接受冠狀動脈梗阻而心臟被放置支架的情況。結(jié)果表明Cpt1b基因敲除組在I-R手術(shù)后4周，心臟功能大幅恢復，達到與損傷前幾乎相同的水平。研究者進一步探究了Cpt1b基因失活后心肌細胞增殖背后的機制，在Cpt1b基因失活的小鼠心肌細胞中，α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，αKG）的水平增加了20倍。高水平的αKG導致KDM5酶活性顯著增加。激活KDM5能去甲基化心肌細胞識別基因，從而恢復這些基因的活性和表達，促進心肌細胞增殖。  

這項科學突破，有望為心肌梗死等心臟病帶來全新治療方法。云克隆構(gòu)建了與該研究相關的心缺血再灌注小鼠模型，具體模型構(gòu)建方法如下：

1. 用3%戊巴比妥鈉80mg/kg腹腔注射麻醉，用小鼠剃毛器剃除小鼠胸部及腋下毛發(fā)（充分暴露手術(shù)區(qū)），用碘酒和75％乙醇手術(shù)區(qū)消毒。

2. 氣管插管：麻醉后，夾趾檢測無反應即可進行I-R手術(shù)。打開外置光源、顯微鏡開關，打開呼吸機，設置好各參數(shù)（呼吸頻率110bpm），將氣管插管沿聲門插入氣管，取下小鼠接上呼吸機，觀察小鼠呼吸狀況，胸廓起伏與呼吸機頻率一致表示插管成功，即可進行I-R手術(shù)。

3. 小鼠采用右側(cè)臥位，用眼科剪在左前肢腋下，用顯微剪于三、四肋間打開胸腔充分暴露心臟，顯微直鑷輕輕夾起少量心包并于左心耳下撕開少許心包，充分暴露左冠狀動脈前降支（LAD）或所在區(qū)域。

4. 結(jié)扎冠狀動脈：于顯微鏡下找到LAD走向或可能所在位置，持針器持取7-0帶針縫合線，于左心耳下緣2mm處進針，縫線穿過LAD，以完全阻斷LAD血流，阻斷LAD血流30min，然后再灌注120min。

5. 關胸：結(jié)扎完成后，6-0縫線完全縫合胸腔開口（保證無縫隙、無錯位）關閉胸腔，由內(nèi)向外逐層縫合各層肌肉和皮膚。

6. 術(shù)后管理：術(shù)后密切關注小鼠狀態(tài)，有無呼吸異常等。待小鼠自然蘇醒后將小鼠從呼吸機上取下并取下氣管插管，正常飼養(yǎng)。

建模后6小時進行模型鑒定，采用的是EB和TTC雙染法，具體實驗方法如下：

1. 配制1.5%的Evans Blue染液、1% TTC染液備用。

2. 麻醉小鼠。

3. 將小鼠開胸，迅速在小鼠心臟前降支血管原結(jié)扎位置處用7-0帶線縫合針進行結(jié)扎。

4. 用止血鉗小心將升主動脈鉗夾，從鉗夾處近心端小心緩慢注射Evans Blue 染液（25g小鼠約0.2mL）可觀察到小鼠心臟迅速變藍，結(jié)扎線以下變化不明顯。

5. 迅速分離出心臟后置于-20或-80 ℃冰箱保存。

6. 按以上步驟收集完所有心臟后，從冰箱中取出心臟，用刀片從心尖部逐層切片，每片約1 mm厚，切 5片。

7. 將切好的心臟片置于TTC染液中避光染色約10~20分鐘，取出后在體式顯微鏡下進行拍照。

EB用于判定缺血區(qū)（不能被染成藍色），TTC染色判定梗死區(qū)（不能被染成紅色）。TTC染色原理是TTC和活細胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應，生成紅色的甲臜，用來表示細胞的活力，是評價腦缺血損傷常用的指標。心缺血再灌注小鼠EB-TTC染色結(jié)果圖如下：非缺血區(qū)呈藍色；梗死區(qū)為白色；而危險區(qū)不會被染色，呈現(xiàn)原有的心肌顏色，為紅色。

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