2024年3月，阿爾伯特-愛因斯坦醫(yī)學(xué)院的研究人員在《 Nature》上發(fā)表了題“Formation of memory assemblies through the DNA-sensing TLR9 pathway”的文章，揭示了與記憶形成相關(guān)的分子機制，發(fā)現(xiàn)記憶形成和DNA損傷及炎癥信號相關(guān)。

圖1. 恐懼情況下的腦部神經(jīng)元活動

（圖片來自《Nature》雜志）

研究團隊通過給小鼠進行短暫、溫和的電擊，形成對電擊事件的情境恐懼條件反射（contextual fear conditioning，CFC），并進一步揭示CFC的形成機制。研究人員在電擊后24-48h對小鼠的頸背神經(jīng)元進行轉(zhuǎn)錄分析，441個基因的轉(zhuǎn)錄水平增加，其中炎癥和TLR信號通路相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平增加最為顯著。接下來，研究人員通過共定位染色實驗發(fā)現(xiàn)，囊泡標(biāo)志物LAMP2蛋白和TLR9蛋白的共同定位增加，揭示TLR9蛋白通過核內(nèi)體的運輸活動增加，這對于DNA的識別和NF-κB的激活有促進作用。TLR9蛋白與cGAS-STING是核外DNA的主要傳感器。在無感染或DNA損傷凋亡的情況下，這些通路通常是沉默的；但在神經(jīng)元應(yīng)激狀態(tài)下，TLR9蛋白會對線粒體DNA片段的釋放做出反應(yīng)。為了確定核外是否具有TLR9激活潛能的dsDNA片段，研究人員收集了正常小鼠和經(jīng)過恐懼訓(xùn)練的小鼠的海馬組織，對核外dsDNA片段進行了克隆和測序，和對照組相比，實驗組小鼠在CFC之后TLR9的假定激活因子的頻率從33%瞬時增加到77%（見圖1），證實CFC能顯著增加TLR9基因的轉(zhuǎn)錄和表達。研究者還使用檢測dsDNA或線粒體DNA的染料對原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物進行了活細胞成像，以區(qū)分非線粒體和線粒體核外DNA，發(fā)現(xiàn)核外非線粒體移動DNA信號水平增加。

圖2. CFC后小鼠神經(jīng)元的DNA損傷和損傷后修復(fù)

（圖片來自《Nature》雜志）

已有研究證實，神經(jīng)元活動可以誘導(dǎo)短暫的DNA斷裂。但是這種斷裂發(fā)生在編碼基因的增強子中，并在數(shù)分鐘內(nèi)得到修復(fù)，不會影響神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)。為了研究CFC產(chǎn)生的核外dsDNA片段的來源，研究人員使用熒光信號標(biāo)記dsDNA斷裂結(jié)合磷酸組蛋白（γH2AX3），并使用圖譜或顆粒分析對信號進行量化。結(jié)果顯示，在CFC發(fā)生數(shù)小時后，CA1核團中具有明顯γH2AX病灶的神經(jīng)元總數(shù)顯著增加。雖然核病灶的數(shù)量隨后減少，但單個神經(jīng)元中出現(xiàn)了更大的γH2AX標(biāo)記病灶，并持續(xù)了6-96h。而標(biāo)記γH2AX蛋白的熒光信號在星形膠質(zhì)細胞或小膠質(zhì)細胞中均未發(fā)現(xiàn)。與核包膜層黏連蛋白B1（LMNB1）的共標(biāo)記檢測顯示，在檢測到最大dsDNA斷裂時，一部分細胞核出現(xiàn)包膜破裂，同時在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)RNA富集區(qū)觀察到γH2AX蛋白信號，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是非活性TLR9的主要定位點。CFC發(fā)生1h后，核包膜破裂數(shù)量明顯增加。核周γH2AX信號與TLR9共定位標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，在某些神經(jīng)元中，γH2AX和dsDNA單獨或以復(fù)合物的形式從含有TLR9的核周部位的細胞核中釋放出來。在較晚的時間點（6-96h）發(fā)現(xiàn)的持續(xù)γH2AX信號直徑為4μm或更大，并與中心體標(biāo)記物γ-微管蛋白共定位，這表明γH2AX定位在中心體周圍，而不是dsDNA斷裂處（見圖2）。中心體是一種存在于大多數(shù)動物細胞的細胞質(zhì)中的一種細胞器，對于協(xié)調(diào)細胞分裂至關(guān)重要。但在不分裂的神經(jīng)元中，受刺激的中心體參與了DNA修復(fù)周期，將單個神經(jīng)元組織成記憶群體。這表明所提出的中心體在分裂細胞中維持基因完整性的作用也適用于進行記憶相關(guān)活動的成體神經(jīng)元。

圖3. 海馬細胞TLR9基因缺失導(dǎo)致情景記憶受損

（圖片來自《Nature》雜志）

為了進一步明確炎癥是學(xué)習(xí)記憶的副作用還是有助于記憶的形成，研究人員構(gòu)建了敲除TLR9的神經(jīng)元細胞系，通過局部注射的方式誘導(dǎo)小鼠CA1背海馬神經(jīng)元TLR9基因缺失。和正常小鼠相比，TLR9基因缺失小鼠在多次測試中的凍結(jié)行為（freezing behaviour）顯著減少，這表明小鼠的情境記憶受損。在野生型小鼠的海馬中注射表達降低TLR9表達的shRNA，也能復(fù)制上述實驗的記憶缺失。由于病毒注射會引起星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)，為了排除這一因素的影響，研究人員注射敲除TLR9的星形膠質(zhì)細胞后未發(fā)現(xiàn)小鼠CFC受到影響。小鼠使用TLR9拮抗劑后也出現(xiàn)相似的凍結(jié)行為，表明失去TLR9基因會妨礙長期記憶的形成（圖3）。

圖4. 海馬神經(jīng)元細胞TLR9基因缺失影響DDR，損害神經(jīng)元纖毛形成

（圖片來自《Nature》雜志）

為了明確TLR9基因缺失在細胞層面產(chǎn)生的影響，研究人員使用相同遺傳品系的小鼠，通過局部注射的方式分別誘導(dǎo)小鼠CA1背海馬神經(jīng)元TLR9基因，Rela基因缺失，Ifnar1基因缺失，并收集他們的海馬細胞。和對照組相比，基因敲除小鼠海馬組織dsDNA斷裂的神經(jīng)元數(shù)量顯著增加。值得注意的是，TLR9和Rela基因的缺失幾乎完全破壞了53BP1蛋白向DNA損傷位點的募集，也阻止了53BP1蛋白向位于中心體內(nèi)的DNA損傷修復(fù)位點的移動，提示TLR9信號在維持神經(jīng)元基因組穩(wěn)定性中的重要作用。海馬組織染色結(jié)果顯示，TLR9和Rela基因的缺失抑制了CA1神經(jīng)元中的纖毛形成，并伴隨著周圍神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)（PNNs）的消失和復(fù)雜性的下降。鑒于PNNs在穩(wěn)定記憶回路中的重要性，這表明TLR9缺失可能導(dǎo)致核內(nèi)和中心體的DNA損傷反應(yīng)受損，致使CFC刺激后的CA1神經(jīng)元無法正確召集DNA修復(fù)復(fù)合物，也無法形成纖毛和PNNs（圖4）。

綜上所述，神經(jīng)元細胞中TLR9信號的缺失會導(dǎo)致DNA損傷，影響DNA修復(fù)，并抑制神經(jīng)元纖毛的形成，還能破壞基因組的穩(wěn)定性，防止小鼠形成長期記憶。因此，維護TLR9信號通路的完整性，可能是一種有前途的神經(jīng)認知缺陷的預(yù)防策略。

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