壞死性凋亡：心血管疾病治療的新靶點(diǎn)與希望
心血管疾病在世界范圍內(nèi)都有著較高的發(fā)病率，是導(dǎo)致死亡的主要原因，因此對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。許多因素，包括遺傳和環(huán)境因素、代謝紊亂、炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和細(xì)胞死亡，都參與心血管疾病的發(fā)病機(jī)制，而細(xì)胞死亡引起的心肌細(xì)胞丟失在心血管疾病中起著至關(guān)重要的作用。作為一種調(diào)節(jié)性壞死形式，壞死性凋亡由死亡受體介導(dǎo)，并通過激活受體相互作用蛋白激酶3(RIPK3)及其下游底物混合譜系激酶樣結(jié)構(gòu)域(MLKL)來執(zhí)行。研究表明壞死性凋亡在心肌穩(wěn)態(tài)、缺血性損傷、病理重塑和心力衰竭中起重要作用。因此，靶向壞死性凋亡信號(hào)通路可能在治療心血管疾病中提供治療益處。
1. 壞死性凋亡與糖尿病心肌病
細(xì)胞死亡是導(dǎo)致糖尿病性心力衰竭的核心事件。然而，在糖尿病心臟中，細(xì)胞死亡途徑的時(shí)間序列和干預(yù)特定細(xì)胞死亡類型的確切時(shí)間在很大程度上仍然未知。復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究所Yunzeng Zou團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡在糖尿病晚期細(xì)胞凋亡后被激活，是導(dǎo)致心功能不全的原因[1]。大麻素受體2(CB2R)是壞死性凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在正常葡萄糖水平下，CB2R在絲氨酸520位點(diǎn)抑制S6激酶介導(dǎo)的BACH2磷酸化，從而導(dǎo)致BACH2易位到細(xì)胞核，其中BACH2轉(zhuǎn)錄抑制壞死性凋亡基因Rip1、Rip3和Mlkl。在高血糖條件下，高葡萄糖以β-arrestin 2依賴性方式誘導(dǎo)CB2R內(nèi)化；此后，MLKL在絲氨酸352位點(diǎn)磷酸化CB2R，并通過泛素修飾促進(jìn)CB2R降解(圖1)。CB2R的心臟再表達(dá)挽救了糖尿病誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞壞死性凋亡和心臟功能障礙，而Bach2的心臟敲除減少了CB2R介導(dǎo)的有益作用。CB2R通過與BACH2相互作用轉(zhuǎn)錄抑制壞死性凋亡；反過來，MLKL形成負(fù)反饋以磷酸化CB2R。這項(xiàng)研究提供了控制糖尿病心功能障礙的一種有前途的替代策略。
圖1 CB2R為中心的分子反饋回路驅(qū)動(dòng)糖尿病性心臟病的壞死性凋亡
2. 壞死性凋亡與缺血/再灌注(I/R)損傷
與PIWI蛋白相互作用的RNA(piRNA)在各種心血管疾病中高度表達(dá)。然而，它們?cè)贗/R損傷引起的心肌細(xì)胞死亡中的作用，仍然難以捉摸。青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院Kun Wang團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一種心臟壞死性凋亡相關(guān)piRNA(HNEAP)，它通過靶向DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)介導(dǎo)的激活轉(zhuǎn)錄因子7(Atf7)mRNA轉(zhuǎn)錄物的5-甲基胞嘧啶(m5C)甲基化來調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞壞死性凋亡[2]。在缺氧/復(fù)氧(H/R)暴露的心肌細(xì)胞和I/R損傷的小鼠心臟中，HNEAP表達(dá)水平顯著升高。HNEAP缺失抑制了小鼠心肌細(xì)胞壞死性凋亡并改善了心臟功能。從機(jī)制上講，HNEAP直接與DNMT1相互作用，并減弱Atf7 mRNA轉(zhuǎn)錄物的m5C甲基化，從而增加Atf7的表達(dá)水平。ATF7可進(jìn)一步下調(diào)壞死性凋亡抑制劑Chmp2a的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致Chmp2a水平降低和心肌細(xì)胞壞死性凋亡的進(jìn)展(圖2)。因此，HNEAP-DNMT1-ATF7-CHMP2A軸可能是減輕缺血性心臟病壞死性凋亡引起的心臟損傷的潛在靶點(diǎn)。
圖2 Atf7在心肌細(xì)胞壞死性凋亡期間調(diào)節(jié)CHMP2A的表達(dá)
3. 壞死性凋亡與血栓形成
血小板是在止血和病理性血栓形成中起核心作用的循環(huán)細(xì)胞。印度巴納拉斯印度教大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所Debabrata Dash團(tuán)隊(duì)證明了MLKL在激動(dòng)劑刺激的血小板轉(zhuǎn)化為活性止血單位最終進(jìn)展為壞死性凋亡的開創(chuàng)性貢獻(xiàn)[3]。凝血酶等生理激動(dòng)劑以PI3K/AKT依賴的方式誘導(dǎo)血小板中MLKL的磷酸化和隨后的寡聚化。抑制MLKL顯著抑制了激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板止血反應(yīng)，包括血小板聚集、整合素激活、顆粒分泌、促凝劑表面生成、細(xì)胞內(nèi)鈣升高、細(xì)胞外囊泡脫落、血小板-白細(xì)胞相互作用和動(dòng)脈剪切下的血栓形成(圖3)。長期暴露于凝血酶會(huì)引發(fā)MLKL寡聚化和移位到質(zhì)膜，形成局灶性簇，導(dǎo)致膜通透性逐漸增加和血小板存活率下降，而PI3K/MLKL抑制劑可以阻止這種情況。總之，MLKL在受刺激血小板從相對(duì)靜止的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ?代謝活躍的血栓前狀態(tài)及其隨后進(jìn)展為壞死性凋亡中起著至關(guān)重要的作用。
圖3 MLKL在激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板活化和壞死性凋亡中發(fā)揮作用
云克隆不僅可提供多種心血管系統(tǒng)疾病模型，包括動(dòng)脈粥樣硬化、心肌肥厚、心肌梗死、心律失常、心力衰竭等，涵蓋常見心血管系統(tǒng)疾病。還具有多個(gè)物種心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞、心包膜成纖維細(xì)胞等原代細(xì)胞產(chǎn)品和各類心血管系統(tǒng)與凋亡信號(hào)通路常用指標(biāo)及上述CB2R、β-arrestin 2、DNMT1、Atf7、PI3K等相關(guān)產(chǎn)品，可助力廣大科研工作者進(jìn)行心血管系統(tǒng)疾病研究。
相關(guān)動(dòng)物模型
心肌肥厚(CH)小鼠模型? DSI548Mu03
建模方法
1. 小鼠選擇：SPF 級(jí)生產(chǎn)的小鼠，選擇 6-8 周齡健康雄性小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
2. 稱重麻醉備皮：準(zhǔn)確稱取小鼠體重（g），行腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠充分麻醉倒（約 3-5min）后，用小鼠剃毛器剃除小鼠頸部及胸前毛發(fā)（充分暴露手術(shù)區(qū)）。
3. 倒置小鼠使小鼠頭部在手術(shù)人員一側(cè) 抬升頭部在 30°，頸部中間豎直開口至胸上肋骨起始處，沿肋骨起始處肋中線向下剪開 0.5mm 擴(kuò)大視野，從頸部氣管鈍性分離至看見胸腺。輕輕撥開胸腺游離脂肪便可清晰觀察到主動(dòng)脈弓，從主動(dòng)脈弓底引 7-0 不可吸收縫合線，連同自制縮窄工具（27G）勒緊打死結(jié)，抽出縮窄工具。完成 TAC 手術(shù)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程保持小鼠體溫 37℃左右。
4. 縫合：結(jié)扎完成后，6-0 縫線完全縫合胸腔前端開口（保證無縫隙、無錯(cuò)位），最后用 5-0 縫線將皮膚切口縫合完整。
5. 術(shù)后管理：術(shù)后密切關(guān)注小鼠狀態(tài)。待小鼠自然蘇醒后，放入干凈的飼養(yǎng)籠，填寫手術(shù)記錄卡片，放回飼養(yǎng)室，密切關(guān)注小鼠術(shù)后狀態(tài)以及死亡情況并做好相應(yīng)記錄。
心肌梗死(MI)大鼠模型? DSI504Ra02
建模方法：
1. 麻醉大鼠，用小動(dòng)物剃毛器剃除大鼠胸部及腋下毛發(fā)（充分暴露手術(shù)區(qū)），用碘酒和 75％乙醇術(shù)區(qū)消毒。
2. 氣管插管：麻醉后，夾趾檢測(cè)無反應(yīng)即可進(jìn)行 MI 手術(shù)。打開外置光源、顯微鏡開關(guān)，打開呼吸機(jī)，設(shè)置好各參數(shù)（呼吸比 2：1，潮氣量 6-8 mL，頻率 70 次 /min），將氣管插管沿聲門插入氣管，取下大鼠接上呼吸機(jī)，觀察大鼠呼吸狀況，胸廓起伏與呼吸機(jī)頻率一致表示插管成功，即可進(jìn)行 MI 手術(shù)。
3. 大鼠采用右側(cè)臥位，用眼科剪在左前肢腋下，用顯微剪于三、四肋間打開胸腔充分暴露心臟，顯微直鑷輕輕夾起少量心包并于左心耳下撕開少許心包，充分暴露左冠狀動(dòng)脈前降支（LAD）或所在區(qū)域。
4. 結(jié)扎冠狀動(dòng)脈：于顯微鏡下找到 LAD 走向或可能所在位置 , 持針器持取 5-0 帶針縫合線，于左心耳根部下方肺動(dòng)脈圓錐旁以 5-0 無創(chuàng)縫合線穿過左冠狀動(dòng)脈前降支 ( LAD)，以完全阻斷 LAD 血流。
5. 關(guān)胸：結(jié)扎完成后，5-0 縫線完全縫合胸腔開口（保證無縫隙、無錯(cuò)位）關(guān)閉胸腔，由內(nèi)向外逐層縫合各層肌肉和皮膚。
6. 術(shù)后管理：術(shù)后密切關(guān)注大鼠狀態(tài)，有無呼吸異常等。待大鼠自然蘇醒后將大鼠從呼吸機(jī)上取下并取下氣管插管，正常飼養(yǎng)。
參考文獻(xiàn)
[1]Gao P, Cao M, Jiang X, et al. Cannabinoid Receptor 2-Centric Molecular Feedback Loop Drives Necroptosis in Diabetic Heart Injuries. Circulation. 2023;147(2):158-174. (IF=35.5)
[2]Wang K, Li FH, Zhou LY, et al. HNEAP Regulates Necroptosis of Cardiomyocytes by Suppressing the m5 C Methylation of Atf7 mRNA. Adv Sci (Weinh). 2023;10(34):e2304329. (IF=14.3)
[3]Ekhlak M, Kulkarni PP, Singh V, et al. Necroptosis executioner MLKL plays pivotal roles in agonist-induced platelet prothrombotic responses and lytic cell death in a temporal order. Cell Death Differ. 2023;30(8):1886-1899. (IF=13.7)