肝細(xì)胞死亡的新視角：壞死性凋亡與肝病治療
肝臟是一個(gè)復(fù)雜的重要器官，負(fù)責(zé)代謝過(guò)程、蛋白質(zhì)合成以及清除毒素和外源性物質(zhì)。肝損傷按持續(xù)時(shí)間分為急性和慢性。最極端形式的急性損傷導(dǎo)致急性肝衰竭；慢性肝損傷是炎癥或細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)引起的長(zhǎng)期和持續(xù)的肝損傷和肝炎的結(jié)果，包括脂肪性肝炎、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性膽管炎和慢性病毒性肝炎。急性和慢性肝損傷導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡?？刂聘渭?xì)胞死亡作為一種肝臟疾病治療策略至關(guān)重要。壞死性凋亡受到越來(lái)越多的關(guān)注，并作為最近發(fā)現(xiàn)的一種不同于壞死和細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡模式被廣泛研究。研究表明，壞死性凋亡信號(hào)通路在肝臟疾病發(fā)作、進(jìn)展和預(yù)后的生理控制中至關(guān)重要。因此，進(jìn)一步分析壞死性凋亡在肝臟疾病中的作用可能為治療干預(yù)提供新的機(jī)會(huì)。
1. 肝細(xì)胞中RIPK3的表觀遺傳沉默可抑制MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡從而阻止肝臟病變
壞死性凋亡是一種高度炎癥性的細(xì)胞死亡模式，與肝損傷包括脂肪性肝炎/非酒精性脂肪性肝炎(NASH)有關(guān)。然而，支持這些說(shuō)法的證據(jù)一直存在爭(zhēng)議。澳大利沃爾特和伊麗莎?霍爾醫(yī)學(xué)研究所Marc Pellegrini試圖確定壞死性凋亡在肝臟病理學(xué)中的作用和相關(guān)性[1]。與對(duì)照組動(dòng)物相比，在缺乏必需壞死性凋亡效應(yīng)蛋白MLKL的小鼠中觀察到相同的感染動(dòng)力學(xué)和病理結(jié)果。當(dāng)喂食高脂肪飲食以誘導(dǎo)NASH時(shí)，缺乏MLKL的小鼠與野生型小鼠無(wú)法區(qū)分。此外，在所有測(cè)試條件下，均不能誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死性凋亡。他們進(jìn)一步對(duì)RIPK3進(jìn)行了DNA甲基化測(cè)序來(lái)研究相關(guān)機(jī)制。結(jié)果表明，在小鼠和人類原代肝細(xì)胞中，RIPK3的啟動(dòng)子區(qū)域被高度甲基化沉默，從而導(dǎo)致壞死性凋亡無(wú)法發(fā)生(圖1)?？偟膩?lái)說(shuō)，這項(xiàng)工作支持小鼠和人類的肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄抑制RIPK3并預(yù)防壞死性凋亡的觀點(diǎn)。
圖1 肝細(xì)胞中RIPK3的表觀遺傳沉默抑制壞死性凋亡
2. NASH中的CD47-SIRPα軸阻斷促進(jìn)肝巨噬細(xì)胞清除壞死性凋亡性肝細(xì)胞并減輕肝纖維化
壞死性凋亡導(dǎo)致NASH的肝細(xì)胞死亡，但壞死性凋亡肝細(xì)胞(necHCs)在NASH中的命運(yùn)和作用仍然未知。美國(guó)紐約哥倫比亞大學(xué)歐文醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)系Ira Tabas團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)necHCs在人和小鼠NASH肝臟中的積累，與necHCs上“別吃我”配體CD47的上調(diào)有關(guān)，并與肝巨噬細(xì)胞上CD47受體SIRPα的增加有關(guān)，這與巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)necHCs清除的受損一致[2]。在兩種飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠模型中，使用抗CD47、抗SIRPα，或使用腺相關(guān)病毒遞送的shCD47來(lái)抑制CD47表達(dá)，結(jié)果顯示肝臟細(xì)胞中的CD47被抑制，促進(jìn)了肝巨噬細(xì)胞對(duì)necHCs的清除，降低了肝星狀細(xì)胞激活標(biāo)志物和肝纖維化(圖2)。這些結(jié)果提示了阻斷CD47-SIRPα軸，是減少NASH肝臟necHCs積累和抑制肝纖維化進(jìn)展的一種治療策略。
圖2 抗SIRPα增加早期NASH小鼠necHC吞噬并改善肝纖維化
3. 轉(zhuǎn)錄因子ATF3將肝脂肪變性的細(xì)胞死亡從凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)閴乃佬缘蛲?/strong>
肝細(xì)胞死亡隨著肝脂肪變性的加重而增加，盡管其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。日本金澤大學(xué)前沿科學(xué)倡議研究所代謝與營(yíng)養(yǎng)研究中心Hiroshi Inoue團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)肝脂肪變性加重將肝細(xì)胞死亡模式從凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)閴乃佬缘蛲?，?dǎo)致肝細(xì)胞死亡增加[3]。他們的研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子ATF3通過(guò)誘導(dǎo)壞死性下垂調(diào)節(jié)因子RIPK3的表達(dá)，在這一轉(zhuǎn)變中起著主調(diào)節(jié)作用。在嚴(yán)重的肝脂肪變性中，部分肝切除術(shù)后，肝臟ATF3缺陷或過(guò)表達(dá)小鼠分別表現(xiàn)出RIPK3表達(dá)和壞死性凋亡減少或增加?；罴?xì)胞成像顯示，在培養(yǎng)的肝細(xì)胞中，ATF3將TNFα依賴的細(xì)胞死亡模式從凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)閴乃佬缘蛲?圖3)。在NASH小鼠中，肝ATF3缺乏抑制RIPK3表達(dá)和肝細(xì)胞死亡。這種ATF3依賴性RIPK3誘導(dǎo)和激活機(jī)制可以成為脂肪變性誘導(dǎo)的肝損傷的治療靶點(diǎn)。
圖3 ATF3將肝細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)化為壞死性凋亡
云克隆不僅可提供多種肝臟疾病動(dòng)物模型，包括肝纖維化、肝缺血、酒精性肝病、肝內(nèi)膽汁淤積、肝硬化、脂肪肝、肝功能衰竭等，涵蓋常見肝臟疾病。還具有還具有多個(gè)物種肝星形細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞、肝間充質(zhì)干細(xì)胞等原代細(xì)胞產(chǎn)品和肝臟疾病常用檢測(cè)指標(biāo)及上述CD47、SIRPα、ATF3等相關(guān)產(chǎn)品，可助力廣大科研工作者進(jìn)行肝臟疾病與壞死性凋亡研究。
肝纖維化(HF)小鼠模型
建模方法：
按5ml/kg體重皮下注射體積分?jǐn)?shù)為20%CCl4的油劑溶液（CCl4：橄欖油 =1:4）, 每3天1次，連續(xù)6周。對(duì)照組動(dòng)物皮下注射等量等次的橄欖油溶劑。正常飲食飼養(yǎng)，觀察動(dòng)物活動(dòng)、精神狀況和飲食量 , 實(shí)驗(yàn)前后稱量小鼠體重。
完成持續(xù)給藥6周后，稱體重，麻醉小鼠，摘眼球取血，室溫靜置2h后于4℃， 3000r離心10分鐘提取血清，放入-80℃冰箱凍存。同時(shí)取肝左葉組織 1.5cm×1cm×0.2cm 于 10% 中性福爾馬林中固定，石蠟包埋；其余肝組織液氮或者-80℃冷凍保存。
肝缺血(HI)小鼠模型
建模方法：
1. 小鼠術(shù)前12h禁食，自由飲水。
2. 麻醉小鼠，麻醉成功后將小鼠平躺在手術(shù)臺(tái)上膠帶固定四肢，將小鼠腹部術(shù)去毛，用碘酒和75％乙醇術(shù)區(qū)消毒。
3. 取腹正中切口 1cm，打開腹腔，小心分離出肝臟供血的門靜脈和肝動(dòng)脈。
4. 用無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉門靜脈和肝動(dòng)脈，0.5min 后，肉眼可見阻斷葉明顯變白，說(shuō)明阻斷成功，用止血鉗夾閉皮膚切口臨時(shí)關(guān)閉腹腔，同時(shí)將小鼠放在37℃恒溫加熱墊上保溫。
5. 完成持續(xù)缺血60min后，重新打開腹腔，迅速取出血管夾，恢復(fù)缺血肝血流，0.5min左右可見缺血區(qū)肝臟由白色逐漸恢復(fù)為鮮紅色表明再灌注成功，逐層縫合腹腔肌肉和皮膚關(guān)閉腹腔，完成手術(shù)。待小鼠清醒后放回飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，密切關(guān)注小鼠的狀態(tài)及生存狀況并做好記錄。
參考文獻(xiàn)
[1]Preston SP, Stutz MD, Allison CC, et al. Epigenetic Silencing of RIPK3 in Hepatocytes Prevents MLKL-mediated Necroptosis From Contributing to Liver Pathologies. Gastroenterology. 2022;163(6):1643-1657.e14. (IF=25.7)
[2]Shi H, Wang X, Li F, et al. CD47-SIRPα axis blockade in NASH promotes necroptotic hepatocyte clearance by liver macrophages and decreases hepatic fibrosis. Sci Transl Med. 2022;14(672):eabp8309. (IF=15.8)
[3]Inaba Y, Hashiuchi E, Watanabe H, et al. The transcription factor ATF3 switches cell death from apoptosis to necroptosis in hepatic steatosis in male mice. Nat Commun. 2023;14(1):167. (IF=14.7)