2024年9月華中科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院黃波教授團(tuán)隊(duì)在《Nature Cell Biology》期刊發(fā)表了題為“Ammonia-induced lysosomal and mitochondrial damage causes cell death of effector CD8⁺ T cells”的研究論文。發(fā)現(xiàn)了氨誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞的一種獨(dú)特形式的細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，快速增殖的T細(xì)胞利用谷氨酰胺分解在線粒體中釋放的氨，然后氨轉(zhuǎn)移到溶酶體并儲(chǔ)存在溶酶體中。過量的氨積累增加溶酶體pH值，導(dǎo)致溶酶體氨儲(chǔ)存終止和氨回流進(jìn)入線粒體，導(dǎo)致線粒體損傷和細(xì)胞死亡，這一細(xì)胞死亡方式與之前發(fā)現(xiàn)的其他形式細(xì)胞死亡機(jī)制不同。

1. 氨誘導(dǎo)CD8⁺效應(yīng)T細(xì)胞死亡

為了探討氨在效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞死亡中發(fā)揮的作用，研究團(tuán)隊(duì)將靶向卵清蛋白（OVA）的CD8⁺ T細(xì)胞（OT-I）過繼轉(zhuǎn)移給小鼠體內(nèi)，隨后感染表達(dá)卵清蛋白的單核增生李斯特菌（Lm-OVA）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氨水平先降低，后逐漸升高，且在輸注后第12天達(dá)到高峰，此時(shí)，OT-I細(xì)胞也大量死亡，推測增加氨濃度可能會(huì)導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞死亡。通過添加外源性NH₄Cl可以誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞死亡，同時(shí)發(fā)現(xiàn)氨甲酰磷酸合成酶1（CPS1）在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞中表達(dá)均缺乏，CPS1是CD8⁺ T細(xì)胞中觸發(fā)尿素循環(huán)并解毒氨中毒的關(guān)鍵酶。在體內(nèi)外過表達(dá)CPS1均可以顯著降低了效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞的死亡同時(shí)降低氨水平。4-苯丁酸（4PBA）是一種通過乙?；c谷氨酰胺結(jié)合形成苯乙酰谷氨酰胺來清除氨的藥物，通過體內(nèi)注射4PBA發(fā)現(xiàn)效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞比例增加同時(shí)氨濃度降低。從形態(tài)學(xué)上，觀察到死亡的效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞在收縮過程中表現(xiàn)出大量的胞質(zhì)空泡，而這在其他形式的細(xì)胞死亡中沒有觀察到。以上結(jié)果表明氨的積累可能在效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞中誘導(dǎo)一種新的細(xì)胞死亡形式。

圖1. 氨可能誘導(dǎo)了效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞中一種新的細(xì)胞死亡形式

2. 谷氨酰胺衍生的氨導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞的死亡

氨主要由谷氨酰胺通過線粒體谷氨酰胺酶1（GLS1）催化產(chǎn)生。為了驗(yàn)證氨的來源，將OT-I細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi)，然后用DON或CB839抑制線粒體谷氨酰胺酶1（GLS1），發(fā)現(xiàn)體內(nèi)氨被明顯抑制同時(shí)脾臟中效應(yīng)T細(xì)胞顯著增加。氨示蹤顯示Lm-OVA感染后8天在效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞中積累的氨源于谷氨酰胺。在Lm-OVA感染后的第1天和第7天，JHU083或CB839抑制GLS1并不影響氨水平，但減少了OT-I效應(yīng)T細(xì)胞的增殖。然而，在第7天和第14天，通過誘導(dǎo)GLS1敲除，可增加效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量并降低氨水平。與此相一致，研究團(tuán)隊(duì)觀察到，在Lm-OVA感染后第8天，谷氨酰胺開始在效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞中積累。

圖2. 谷氨酰胺衍生的氨導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞的死亡

3. 氨損傷效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞溶酶體

接下來探討氨誘導(dǎo)效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞死亡的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，上述效應(yīng)T細(xì)胞的溶酶體中的氨的水平逐漸升高，并在細(xì)胞死亡時(shí)達(dá)到最高水平，氨示蹤證實(shí)溶酶體內(nèi)氨來源于線粒體。隨著氮水平的增加，溶酶體pH值也會(huì)增加，pH值的改變可能會(huì)損傷溶酶體。隨后觀察到，氨水平的增加確實(shí)顯著降低了胱天蛋白酶B、胱天蛋白酶D、β-半乳糖苷酶和α-甘露糖苷酶的活性且溶酶體膜通透性（LMP）顯著升高。而當(dāng)GLS1抑制劑作用時(shí)，則可以抑制上述結(jié)果的出現(xiàn)。這些結(jié)果表明，氨從線粒體輸出并儲(chǔ)存在溶酶體中并損傷溶酶體。那么，氨是怎么進(jìn)入溶酶體的呢？最近的研究表明RH家族糖蛋白（RHAG，RHBG和RHCG）可以作為氨轉(zhuǎn)運(yùn)體，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞高表達(dá)RHCG，RHCG的增加出現(xiàn)在晚期激活的效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞的膜旁細(xì)胞器中，特別是在溶酶體中。溶酶體中的氨含量上升，線粒體中的氨含量下降，細(xì)胞總氨含量不變，這種RHCG過表達(dá)可以加速效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞的死亡，給予GLS1抑制劑可以抑制上述結(jié)果的出現(xiàn)。這說明線粒體排出的氨通過RHCG轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中。因此，溶酶體pH值的增加在氨死亡中起著關(guān)鍵作用，并可能是這種細(xì)胞死亡的一個(gè)指標(biāo)。

圖3. 氨損傷效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞溶酶體

4. 氨滯留導(dǎo)致線粒體損傷

以上結(jié)果表明，氨從線粒體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，然后進(jìn)入溶酶體。然而，高濃度的溶酶體氨可能會(huì)阻止溶酶體吸收胞質(zhì)氨，導(dǎo)致線粒體氨滯留。與此一致，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在刺激8天的T細(xì)胞中觀察到線粒體氨水平升高且線粒體膜電位降低，這種高濃度的氨可能會(huì)導(dǎo)致線粒體損傷。進(jìn)一步觀察到晚期和早期效應(yīng)T細(xì)胞中線粒體數(shù)量并沒有變化，但晚期效應(yīng)T細(xì)胞中線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)明顯降低，并觀察到線粒體形態(tài)損傷，包括細(xì)胞膜和嵴結(jié)構(gòu)破壞，嵴數(shù)量減少。為了證實(shí)觀察到的線粒體損傷與氨滯留有關(guān)，研究團(tuán)隊(duì)在體內(nèi)過表達(dá)CPS1以降低氨水平，或使用GLS1抑制劑來抑制過繼轉(zhuǎn)移的OT-I細(xì)胞中氨的形成。在這兩種情況下，受損的線粒體可以被逆轉(zhuǎn)。

圖4. 氨滯留導(dǎo)致線粒體損傷

5. 損傷的線粒體不能通過自噬被清除

受損的線粒體被一種稱為線粒體自噬的選擇性自噬過程所消除，然而，在晚期激活的效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞中觀察不到線粒體吞噬體樣結(jié)構(gòu)，且參與線粒體自噬的兩個(gè)關(guān)鍵蛋白PINK1和Parkin的表達(dá)水平?jīng)]有改變。LC3與線粒體共定位可作為線粒體吞噬的標(biāo)記物，同樣，在第4天和第12天的效應(yīng)T細(xì)胞中幾乎沒有觀察到這種共定位。這些結(jié)果表明，線粒體自噬并不能有效地清除晚期激活的效應(yīng)T細(xì)胞中受損的線粒體。除了線粒體自噬，巨自噬在晚期激活的效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞中似乎受損，盡管形成了自噬小體，但p62效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞的積累提示自噬流被中斷。然而，用C381（一種靶向空泡型ATP酶的小分子來降低溶酶體pH）可以恢復(fù)損傷的自噬流，且C381處理降低了活化的OT-I效應(yīng)T細(xì)胞死亡。

圖5. 損傷的線粒體不能通過自噬被清除

6. 氨死亡阻斷增強(qiáng)了對癌癥的過繼T細(xì)胞治療

最后，將OT-I 效應(yīng)T細(xì)胞過繼地轉(zhuǎn)移到B16-OVA黑色素瘤荷瘤小鼠中，在第4-10天解剖腫瘤浸潤的OT-I細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)氨積累且溶酶體pH增加。為了確定氨的積累是否影響OT-I效應(yīng)T細(xì)胞的持久性，使用C381或JHU083對B16-OVA荷瘤小鼠進(jìn)行預(yù)處理3天，并在OT-I效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)移后繼續(xù)進(jìn)行這種處理，14天后發(fā)現(xiàn)可抑制腫瘤生長，延長小鼠存活時(shí)間。通過誘導(dǎo)性的GLS1的敲除和過表達(dá)CPS1的OT-I T細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移，均得到了類似的結(jié)果。這些結(jié)果表明，氨阻斷通過改善T細(xì)胞的持久性來增強(qiáng)過繼T細(xì)胞治療癌癥。

圖6. 氨阻斷通過改善T細(xì)胞的持久性來增強(qiáng)過繼T細(xì)胞治療癌癥

云克隆開發(fā)了與該研究相關(guān)的靶標(biāo)產(chǎn)品，部分靶標(biāo)節(jié)選如下：